论文部分内容阅读
光自养生物光系统末端的铁氧还蛋白-NADP还原酶(FNR),利用光合作用产生的电子再生NADPH,为生物合成提供还原力。但NADPH作为天然辅酶,参与众多胞内代谢途径,无法选择性地将还原力传递到目标途径,降低了还原力利用效率及可控性。人工辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)具有NAD(P)的还原力传递能力,同时不被天然代谢途径识别,可降低代谢系统复杂性,将还原力特异性地传递给目标途径。本论文结合FNR结构分析、高通量筛选方法设计,通过蛋白定向进化策略对,Synechocystis sp.PCC 6803来源的FNR进行突变改造,筛选具有NCD偏好性的FNR突变型,利用光合作用产生的还原力再生NCDH,以实现还原力的选择性传递。同时针对NCD无法胞内合成且跨膜运输效率低的问题,建立高效NCD转运策略。取得主要成果如下:建立基于辅酶循环显色的高通量活性检测方法以及基于HpaB-FNR融合蛋白的平板显色高通量筛选策略。通过模拟及分析FNR结构,确定了 10个可能影响FNR辅酶偏好性的活性位点。建立对应的单位点饱和突变文库、双位点饱和突变文库与随机突变文库。筛选了4个单位点饱和突变文库、9个双位点饱和突变文库和一个随机突变文库,每个单位点文库筛选200个转化子,每个双位点文库筛选2000个转化子,随机突变筛选4000个转化子。野生型FNR检测不到NCD活性,对NAD活性为340 U/mg,对NADP的活性高达344679 U/mg。筛选到的 FNR I158R/K311T/R340A/R349D 对 NCD 活性为 80 U/mg,对 NAD 的活性为 642 U/mg,对 NADP 活性为 3419 U/mg。突变型 FNR K311T/R340A/R349D 对 NCD活性为58 U/mg,对NAD的活性为561 U/mg,对NADP的活性为164 U/mg。结合蛋白结构模拟及分析,探究了 FNR辅酶特异性提高的机理,K311、R340和R349位于NADP结合结构域中与NADP的3位磷酸结合的区域,K311T、R340A与R349D这三种突变,使NADP结合结构域空间变小,碱性氨基酸变为酸性或中性氨基酸,不利于NADP的结合,对NAD和NCD的亲和力增大,1158也位于NADP结合结构域中,I158R突变使NADP结合结构域开口处空间变小,提高了酶的NAD/NADP特异性。通过提高外加辅酶稳定性和选择高活性辅酶转运蛋白,建立了高效NCD跨细胞膜转运策略。使用敲除焦磷酸水解酶(UshA)编码基因的Escherichiacoli BW25113菌株(丑coli△ushA)为宿主,减弱胞外辅酶的降解,与使用野生型E.coli BW25113为宿主相比,胞外NAD与NCD的稳定性分别提高了 8倍与11倍。比较了Protochlamydia amoebophila UWE25来源的转运蛋白NTT4与Arabidopsis thaalian线粒体来源的AtNDT2转运NAD与NCD的效率,NTT4转运活性更高,转运NAD与NCD的效率分别是AtNDT2的3倍和18倍。使用表达NTT4的E.coli △ ushA转运NCD等NAD类似物及NAD,确定转运NAD与NCD对菌株生长无影响,说明NCD无生物毒性。本研究筛选具有NAD或NCD偏好性的FNR突变型,研究突变型FNR结构和功能的对应关系,加深了对FNR功能与结构联系的了解,为高效特异地传递光生还原力提供了基础。建立了高效NCD转运策略,推动了 NCD等NAD类似物在胞内的研究和应用。