论文部分内容阅读
巴贝斯虫病通常又称为蜱传热或焦虫病等，是由媒介蜱传播、流行程度仅次于锥虫病的一种哺乳动物血源性寄生虫病，给热带和亚热带国家的畜牧业造成严重的威胁和经济损失。开发有效的抗巴贝斯虫药物是本病防控的有效手段。存在于牛巴贝斯虫顶质体内的类异戊二烯代谢途径被证实是虫体生命代谢的必须途径，且有别于哺乳动物类异戊二烯生物合成途径，因此，该途径中的代谢相关酶成为筛选抗虫药以及抗菌素的重要靶标。本文对牛巴贝斯虫陕县株（Babesia bovisShannxian）MEP途径相关酶进行了克隆，并着重对DXS酶进行了研究。1.以B.bovis Shannxian株cDNA为模板扩增出MEP(methylerythritolphosphate, MEP)途径的7个基因序列，并进行了BLAST分析。结果表明，dxs（GenBank ID：KF694747），dxr（GenBankID：KJ558379）；IspD（GenBank ID：KF939613）；IspE（GenBank ID：KJ558383）；IspF（GenBankID：KJ558380）；IspG（GenBank ID：KJ558382），IspH（GenBank ID：KJ558381）推导氨基酸序列与其目的序列的相似性均可达90%以上，目的基因正确，为进一步研究该途径中的其他基因奠定了基础。2.克隆了dxs基因的5’和3’端序列，构建了携带WR99210/hDHFR筛选系统和GFP荧光报告基因的敲除dxs基因的同源重组载体DHFR-gfp-DXS KO；并成功构建了携带报告基因的真核和原核表达载体，为验证dxs基因的功能和DXS酶的性质提供了材料。3.对重组BbDXS的表达条件进行优化，并纯化得到了可溶性重组BbDXS酶，利用液相质谱联用仪对其酶动力学参数进行了测定，结果表明Kpyr-1m=790±52μM，Kcat为7.4S；KGAPm=380±46μM，Kcat为10.2S-1。4.在pET-DXS重组原核表达载体的基础上构建了六个点突变BbDXS表达载体，对比未突变蛋白催化产物量，结果表明Asp209、Ile415和Asp474对BbDXS的活性影响较大，可能由于其参与了TPP或底物小分子的结合。5.分析了底物与EcDXS与底物和抑制剂的作用方式，结果表明丙酮酸与EcDXS结合的分子可能有Glu348和Gly349，以氢键形式结合。而ketoclomazone与EcDXS对接有两种可能，一种是抑制剂与Arg99和Arg478形成氢键，这两位氨基酸参与底物GAP(D-glyceraldehyde3-phosphate)的结合；另一种是与Arg347、Glu348和Gly349以氢键结合，这三个氨基酸可能参与丙酮酸与酶的相互作用。因此，ketoclomazone可能是由于抑制了底物分子与酶的结合而发挥抑制作用。以BbDXS结构与TPP对接结果表明Phe442、Tyr439、Gly176、Ser178、Gly210和Ser211在对TPP的相互作用中起重要作用，且在多序列比对中保守。丙酮酸与在BbDXS对接结果表明Asn236、Gly208和Gln136参与丙酮酸与酶的结合作用。6.在DS平台上，以现有的DXS小分子抑制剂为基础构建药效团模型，并对小分子库进行筛选，得到2518个小分子，其中FitValue值大于3的共160个，进一步将这160个小分子与EcDXS进行对接，共筛选到46个与酶结合较好的小分子，为进一步开发DXS的抑制剂药物奠定了基础。