目的：目前白木香生产存在自然结香(形成沉香)周期长、产量低、传统人工刺激结香技术落后、缺乏综合利用措施、药农生产负担沉重等关键生产问题,其问题核心就是结香与综合利用技术落后。为了显著提高白木香产量,推动白木香综合开发利用水平的提升,本团队系统开展了刺激结香新技术与白木香综合开发利用研究,以期为白木香生产与综合开发利用提供研究范例和科学依据。方法：1刺激结香研究1.1给药方式和结香剂的初步筛选1.1.1刺激结香给药方式筛选选取8年生健康白木香树作为实验对象,设计刮皮给药、打孔注射、输液、全脱叶、环剥等处理和给药方式,观察记录刺激后一周、一个月、三个月、半年时间点的树干、枝条、树叶生长情况,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,对比研究刺激结香给药途径。1.1.2刺激结香剂筛选选取8年生健康白木香树作为实验对象,设计1号结香剂、噻苯隆、2,4-D、A-萘乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、青鲜素、3-吲哚丁酸钾、双氧水、醋酸、茉莉酸甲酯等试药刺激,观察记录刺激后一周、一个月、三个月、半年时间点的树干、枝条、树叶生长情况,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,对比研究最佳刺激剂。1.2目标结香剂结香方法的系统研究1.2.1结香剂使用安全性评价选取8年生健康白木香树作为实验对象,设计4%、6%、8%、10%浓度的1号结香剂进行处理,观察记录刺激后一周、一个月、三个月、半年时间点的树干、枝条、树叶生长情况,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,研究试药处理安全性。1.2.2结香剂最适使用浓度筛选选取8年生健康白木香树作为实验对象,设计3%、4%、5%、6%浓度的1号结香剂进行处理,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,并估算1年期末结香产量,研究最佳试药浓度。1.2.3输液孔数对刺激结香的影响考察选取8年生健康白木香树作为实验对象,设计输液孔数2、4、8,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,研究最佳输液孔数。1.2.4刺激结香采收期考察与产量估计选取8年生健康白木香树作为实验对象,在最佳给药处理方式的基础上,观察记录刺激后三个月、半年、九个月、一年时间点的给药部位周边木部变色情况、变色范围及燃烧气味,并估算各期期末结香产量,研究最佳采收期。1.2.5结香质量对比评价以火烫法、断干法、砍伤法、蚁蛀、虫漏、断枝法、霉菌感染等不同结香方式所获沉香和沉香对照药材为参照,评价应用最佳刺激结香技术所获沉香的质量；按照《中国药典》2010年版(一部)中沉香药材的要求,检查各批沉香药材的性状特点,依照《中国药典》2010年版(一部)附录Ⅸ H“水分测定法”项下“第三法(减压干燥法)”测定含水量,依照《中国药典》2010年版(一部)附录X A“浸出物测定法——醇溶性浸出物测定法”项下“热浸法”测定醇溶性浸出物含量,通过冷浸法测定乙醚浸出物含量；应用HPLC-PDA法测定最佳刺激结香技术所获沉香中Aquilarone B、 Aauilarone C、Aauilarone D、Aauilarone E及(5S.6R.7R.8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基、)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮等5种色酮类成分的含量,并计算加和含量。2白木香叶综合利用开发研究2.1白木香叶成分分离鉴别研究应用回流提取、萃取除杂、半制备柱分离等技术,结合HPLC纯度检测技术,分离获取白木香叶中的单体成分,经理化性质测定、UV、NMR等色谱、波谱技术分析并鉴定其结构。2.2白木香叶中芒果苷的含量测定及时空变化规律研究以芒果苷作为白木香叶的指标性成分,分别建立白木香叶中芒果苷的HPLC-PDA和UPLC-PDA测定方法,并作对比分析,借助所建立的UPLC-PDA含量测定方法对影响白木香叶中芒果苷含量的分布部位、产地、树龄等因素进行分析,以芒果苷含量为指标确定最佳采收期、制定合理储存期,从而探索芒果苷的动态变化规律。2.3芒果苷提取工艺研究以所建立的芒果苷UPLC-PDA测定方法为监测手段,以芒果苷提取率为指标,在考察乙醇浓度、液固比、提取时间、提取温度等单因素实验的基础上,通过正交实验设计,探索芒果苷的最佳提取工艺。2.4工业化制备高纯度芒果苷的工艺研究在芒果苷提取工艺研究的基础上,以芒果苷的纯度和得率为指标,结合工艺生产的简易性和经济性要求,通过工艺改进,制定高纯度芒果苷的工业化提取方案。结果：1刺激结香实验结果1.1给药途径及结香剂的初步筛选1.1.1给药途径筛选实验结果刮皮空白组、刮皮阴性对照组、刮皮涂甲酸组、刮皮涂1号结香剂组、打孔空白组、打孔阴性对照组、输液空白组、输液阴性对照组、全脱叶组、环剥皮组在刺激后一周、一个月、三个月、半年观察期内树体生长正常,枝叶生长情况无明显变化；打孔注甲酸组、打孔注1号结香剂组、输甲酸组、输1号结香剂组在刺激后一周、一个月、三个月、半年观察期内树体生长正常,叶出现变黄或脱落,其中打孔注1号结香剂组和输1号结香剂组树木生长所受影响最大,叶基本脱落完全,并出现小枝死亡；刮皮空白组、刮皮阴性对照组、打孔空白组、打孔阴性对照组、全脱叶组、环剥皮组、输液空白组、输液阴性对照组在刺激后三个月、半年、九个月、一年观察期内处理部位无明显颜色变化,燃烧基本不产生香味或极淡香味,显示基本无沉香产生和积累；刮皮涂甲酸组、刮皮涂1号结香剂组、打孔注甲酸组、打孔注1号结香剂组、输甲酸组在刺激三个月后处理部位出现明显颜色变化,并随着半年、九个月、一年观察时间的增长,影响区域逐渐增大,颜色逐渐加深、燃烧气味逐渐变香浓,其中以输1号结香剂组影响区域最大、颜色变化明显、燃烧香味较浓,提示产生沉香较多。1.1.2刺激结香剂筛选结果空白对照组、阴性对照组、双氧水组、茉莉酸甲酯组在刺激后一周、一个月、三个月、半年观察期内树体生长正常,枝叶生长情况无明显变化；1号结香剂组、噻苯隆组、2,4-D组、A-萘乙酸组、2,3,5-三碘苯甲酸组、青鲜素组、3-吲哚丁酸钾组、酵酸组在刺激后一周、一个月、三个月、半年观察期内树体生长正常,但叶出现变黄或脱落,其中1号结香剂组所受影响较大,叶基本脱落完全,并出现部分小枝死亡；空白对照组、阴性对照组、双氧水组、茉莉酸甲酯组在刺激后一年观察期内处理部位无明显颜色变化,燃烧基本不产生香味或极淡香味,基本无沉香产生和积累；1号结香剂组、噻苯隆组、2,4-D组、A-萘乙酸组、2,3,5-三碘苯甲酸组、青鲜素组、3-吲哚丁酸钾组、醋酸组在刺激三个月后处理部位出现明显颜色变化,并随着观察时间的增长,影响区域逐渐增大,颜色逐渐加深、燃烧气味逐渐变香浓,其中以1号结香剂组影响区域最大、颜色变化明显、燃烧香味较浓,产生沉香较多,提示宜作为目标结香剂。1.2目标结香剂结香方法的系统研究结果1.2.1目标结香剂使用安全性评价结果4%、6%浓度的1号结香剂组在刺激三个月后处理部位出现明显颜色变化,并随着观察时间的增长,影响区域逐渐增大,颜色逐渐加深、燃烧气味逐渐变香浓,但6%浓度组因出现局部树体死亡,导致最终结香区域小于4%浓度组。8%、10%浓度组在刺激三个月后均出现树体死亡,变色区域燃烧气味不良。1.2.2目标结香剂最适使用浓度筛选结果刺激三个月后3%、4%、5%、6%浓度组均在处理部位出现明显颜色变化,并随着观察时间的增长,影响区域逐渐增大,颜色逐渐加深、燃烧气味逐渐变香浓,3%、4%浓度组结香颜色、区域大小、燃烧香味基本一致,无显著差异,5%、6%浓度组因出现局部树体死亡,导致最终结香区域小于其他组。3%、4%、5%、6%组产香体积约分别达到4792、4920、4460、4184cm3。1.2.3输液孔数考察结果两孔组、四孔组、八孔组均在刺激三个月后处理部位出现明显颜色变化,并随着观察时间的增长,影响区域逐渐增大,颜色逐渐加深、燃烧气味逐渐变香浓；但两孔组产香区域远大于四孔组和八孔组。1.2.4刺激结香采收期考察与产量估算结果经优选的1号结香剂处理,树干处理部位在第三个月可观测到灰白色变色部位,但基本无香气；半年后产生明显褐变,形成产香区,六个月、九个月、十二个月产香区依次估算为3022、4358、4792 cm3,根据燃烧香味划分等级分别判定为下等香、中等偏下香、中等香,故实验期内以刺激一年后沉香产量和等级最高。1.2.5结香质量对比评价结果火烫法所获沉香为梭片、棕黄色、质地坚硬、燃烧香味浓,断干法所得沉香为厚片、棕褐色、轻脆、燃烧香味浓,砍伤法所获沉香为碎块、棕褐色、质地轻脆、燃烧香味浓,自然蚁蛀所获沉香为碎条或碎片、黄白色或淡黄棕色、质地坚韧、燃烧香味较浓,虫漏所获沉香多大块或碎块、黑棕色、质地坚脆、燃烧香味浓,断枝法所获沉香为碎块、淡棕色、质地轻泡、燃烧香味中等,自然霉菌感染所获沉香为薄片、淡棕色、质地轻泡、燃烧香味较淡,1号结香剂刺激所得样品为扁担状长条形(取样前)、黄棕色、质地坚脆,燃烧香味中等。所测沉香样品含水量在6.51%～9.07%之间,其中对照药材含水量为8.68%,1号结香剂组所得样品含水量在7.67%～8.54%之间；醇溶性浸出物含量在10.03%-24.88%之间,其中对照药材醇溶性浸出物含量为11.19%,1号结香剂组为10.61%-12.39%之间。所测沉香样品醚溶性浸出物含量在0.61%-8.06%之间,其中对照药材醚溶性浸出物含量为1.07%,1号结香剂组在1.43%-1.92%之间；HPLC测定结果显示各批沉香样品中Aquilarone B、Aquilarone C、Aquilarone D、 Aquilarone E、(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮等五种色酮单体的含量差异显著,所测样品五种色酮的加和量在1.9257-12.1821mg·g-1之间,对照药材为11.7852 mg·-1,三批1号结香剂组样品在4.4592-5.1076mg·g-1之间。2综合利用开发研究2.1成分提取分离研究结果从白木香叶70%乙醇提取液中,分离获得一个高含量的化合物单体,结合理化性质、光谱、波谱数据鉴定为芒果苷。2.2芒果苷含量测定及时空变化规律研究结果建立了白木香叶中芒果苷含量测定的HPLC-PDA方法,色谱峰分离度大于1.5,线性范围68.8-688ng,得回归方程y=4972.6x-22524(R2=0.9999),高、中、低平均加样回收率分别为98.16%、98.48%、98.12%,RSD值为0.59%、0.55%、0.50%。建立了白木香叶中芒果苷含量测定的UPLC-PDA方法,色谱峰分离度大于1.5,线性范围3.44-172.00ng,得回归方程y=15819.3263x+16717.5036(R2=0.9999),高、中、低平均加样回收率分别为98.38%、98.53%、98.29%,RSD值为0.63%、0.50%、0.45%。白木香各部位芒果苷含量如下,初生叶5.12%,老叶2.96%,初生枝皮4.81%,初生枝木2.13%,花4.54%,绿果皮1.23%,种子、老枝皮、树皮、老枝条、主干未检出；恩平沉香基地、湛江南药基地、电白君元沉香基地、广州中医药大学药王山所采白木香叶中芒果苷的含量分别为3.73%、3.86%、3.43%、4.34%,产地影响较小；两年生至十年生树叶中芒果苷的含量介于3.64%-4.06%之间,树龄影响较小；白木香叶芒果苷含量峰值分别出现在3月(4.37%)和9月(3.91%),白木香叶生长规律为3月初生叶嫩、芒果苷含量高,但总产量相对较低,而9月多为老叶、芒果苷含量略低,但总产量相对较高；在适宜条件下储存1年后,白木香芒果苷含量下降0.24%,三批叶最大折损率均值为6.25%。2.3芒果苷提取工艺研究结果低于70%,醇浓度与芒果苷提取率呈正相关；70%乙醇,芒果苷提取率达到峰值；高于70%,醇浓度与芒果苷提取率呈负相关。液固比与芒果苷提取率正相关,液固比达到20倍以上时,芒果苷提取率增速减缓。1.25h以内,提取时间与芒果苷提取率呈正相关；1.25h芒果苷提取率达到峰值；超出1.25h,提取时间与芒果苷提取率呈负相关。低于90℃,提取温度与芒果苷提取率呈正相关；90℃芒果苷提取率达到峰值；高于90℃,提取温度与芒果苷提取率呈负相关。正交实验结果表明：提取因素中乙醇浓度对芒果苷提取率影响最大,提取温度影响最小,各因素对芒果苷提取率的影响程度依次为乙醇浓度>液固比>提取时间>提取温度,各影响因素均不具有显著性差异,最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%,液固比为20,提取时间为1h,提取温度90℃,提取2次。在最佳提取工艺条件下进行样品量50倍放大的实验验证,重复5次,结果5次实验得到提取液中芒果苷平均含量为3.25%,RSD值为0.96%。2.4工业化制备高纯度芒果苷的工艺研究结果从白木香叶中制备高纯度芒果苷的工业化生产工艺为：取沉香叶粗粉1000g,加入7000mL 70%乙醇溶液热回流1h,过滤,药渣重复上述提取步骤一次,合并滤液,70℃减压回收至无醇味,加蒸馏水至2000mL,放置12h,倾出上清液,备用；上清液80℃继续减压回收到500mL,缓慢加入2500mL无水乙醇,静置12h,倾出上清液,备用；上清液75℃回收到1000mL,倒出,静置24h,抽滤,沉淀用少量无水乙醇、蒸馏水洗涤沉淀,滤液继续75℃回收到250mL,倒出,静置24h,抽滤,沉淀用少量无水乙醇、蒸馏水洗涤沉淀,合并沉淀得粗品,备用；粗品用50%乙醇溶液加热溶解完全至饱和状态,5%盐酸溶液调节PH值到3.0,放置24h,过滤,少量无水乙醇、蒸馏水洗涤沉淀,70℃以下干燥沉淀,即可；最终从1000g白木香叶中制得芒果苷26.4648g,纯度为97.71%,转移率75.39%。结论：1刺激结香研究结论1.1给药途径及结香剂的初步筛选研究结论应用输液法整体造香优于其他造香给药方式,1号结香剂造香效果优于其他结香剂。1.2目标结香剂结香方法的系统研究结论1号结香剂的安全使用浓度为6%以下,综合成本因素,3%浓度的1号结香剂输液造香效果最优,宜采用两孔输液法输液,其药材采收期暂定一年。1号结香剂可诱导白木香产生通体结香,一年内可获得均产4792 cm3的中等品质沉香的效果,产量已得到显著提升。综合外观性状、醇溶性浸出物含量、醚溶性浸出物含量及五种色酮含量分析,1号结香剂刺激所得沉香质量属于中等水平,其质量已基本符合《中国药典》2010年版“沉香”项下质量要求。2综合利用开发研究从白木香叶中,分离获得一个高含量的化合物单体,鉴定为芒果苷,首次建立了其HPLC-PDA和UPLC-PDA定量方法。白木香部位芒果苷含量表现为初生叶>初生枝皮>花>老叶>初生枝木>绿果皮,采收时可连花带嫩枝一并采收；产地、树龄对白木香叶中芒果苷含量影响较小,暂未发现区域、树龄特异性；从叶产量、用途以及提取得率综合考虑,采集白木香叶提取芒果苷的最佳时间为每年九月；白木香叶储存期暂定为一年。从白木香叶中提取芒果苷的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%,液固比为20,提取时间为1h,提取温度90℃,提取2次。采用本文首创的溶剂法从白木香叶中制备高纯度芒果苷的技术,每1000g白木香叶制得芒果苷26.4648g,纯度为97.71%,转移率75.39%；该工艺具有提取成本低,不带入污染和有害物质,成品质量高等优点,从而为白木香叶的综合利用提供了科学的方法和途径。