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维药香青兰是新疆地区特色药材,目前以香青兰为原料的药物制剂“益心巴迪然吉布亚颗粒”已上市,研究证明香青兰具有明确的抑制血小板活化、稳定血小板功能的作用。而香青兰发挥稳定血小板功能的作用机制主要与其香青兰总黄酮及其单体田蓟苷等活性成分有关。研究表明香青兰能够抑制核转录因子NF-κB活化,下调多种炎性因子、黏附分子及细胞生长因子从而发挥抗血小板聚集、抑制血栓形成及抗内皮细胞活化、抑制其增殖的作用。而NF-κB能够激活控制细胞增殖、新生血管形成以及趋化因子和细胞因子生成的基因,这也是促肿瘤形成的一个机制。现代肿瘤学研究表明,肿瘤血管的生成及由此介导的肿瘤生成、侵袭及转移与内皮细胞及血小板活化、血栓形成联系密切。肿瘤诱导的内皮细胞及血小板活化和血小板及内皮生长因子诱导的肿瘤生长及传播形成了一个恶性循环,针对血小板及内皮细胞的活化和聚集功能的调节有可能打破该循环,维持正常的血液内环境,抑制肿瘤内血管新生过程,发挥抗肿瘤功效。作为天然药用植物,香青兰不仅具有下调多种黏附分子作用,而且还具有抗炎、抗氧化、抑制钙离子内流等众多药理机制,具有从多环节抑制血小板聚集以及抗内皮细胞活化,从而更加稳定地发挥抗血栓形成及抑制内皮细胞增殖作用的优势。那么香青兰的活性单体田蓟苷能否通过这一机制抑制内皮细胞及血小板的活化,并进一步发挥相应的抗肿瘤作用呢?本课题利用体外细胞实验及荷瘤裸鼠动物模型,通过分子生物学及病理学研究,考察香青兰总黄酮的活性单体田蓟苷通过调节P-selectin影响血小板功能,抑制肿瘤血管生成,从而用于肿瘤防治的可能性,探索香青兰药材在抗肿瘤新领域的应用前景。1.田蓟苷细胞毒性评价通过CCK-8检测法对各浓度田蓟苷及内皮细胞刺激因子TNF-α对内皮细胞EA.hy926的毒性作用进行了评价,考察了田蓟苷及TNF-α的体外细胞毒性,拟定后续体外细胞实验的使用浓度:TNF-α以终浓度为25ng/ml的培养体系激活内皮细胞;TIL终浓度为40μg/ml左右的培养体系用以干预经TNF-α激活的内皮细胞。2.田蓟苷对内皮细胞黏附分子表达的影响采用Western Blot实验法对田蓟苷干预活化的内皮细胞P-selectin、VEGF和VCAM-1的蛋白表达情况进行检测,以考察田蓟苷对哪些内皮细胞粘附分子具有调控作用。结果发现TNF-α诱导的内皮细胞表达VCAM-1蛋白的情况被田蓟苷抑制得最为显著,对P-selectin的过表达也有轻微抑制作用,而VEGF的表达量经TNF-α的刺激反而略有降低,经田蓟苷干预后表达量更低。3.田蓟苷对内皮细胞黏附分子基因调控的影响采用Real time PCR检测法,以GAPDH为内参基因,半定量地测定了VCAM-1、P-selectin及VEGF的m RNA表达情况,结果证实VCAM-1及P-selectin的m RNA表达变化趋势与蛋白层面相一致,田蓟苷对TNF-α刺激后表达增加的VCAM-1和P-selectin有抑制作用。而VEGF的变化不同于蛋白水平的检测,经TNF-α刺激后m RNA表达上调,田蓟苷的干预抑制了其表达。4.田蓟苷人肺腺癌裸鼠移植瘤生长的研究首先通过肿瘤组织块移植法建立人肺腺癌裸鼠移植瘤模型,比较田蓟苷与阳性对照药重组人血管内皮抑制素对裸鼠肿瘤生长早期的抑制作用,实验中可观察到田蓟苷组裸鼠肿瘤生长较为缓慢,肿瘤抑制率高于阳性对照药组,但结果不具统计学意义。其次取瘤组织切片进行免疫组化染色,测定P-selectin、VCAM-1及VEGF水平,并通过CD34染色水平分析,计算裸鼠肿瘤微血管密度(MVD),以考察田蓟苷对裸鼠肿瘤微环境及血管生成的影响,结果证实了经田蓟苷的干预,荷瘤裸鼠的肿瘤组织内P-selectin及VCAM-1的表达降低,而VEGF的表达没有变化,说明田蓟苷对裸鼠的肿瘤生长及肿瘤内血管生成的抑制作用可能与Pselectin及VCAM-1这两种细胞黏附分子有关。