灰飞虱Laodelphax striatellus以水稻、小麦和玉米等作物的韧皮部汁液为食,同时,灰飞虱也是一种媒介昆虫,通过取食传播水稻条纹叶枯病(Rice stripe virus,RSV)和黑条矮缩病(Rice black-streak dwarf virus,RBSDV)等多种植物病毒病,已成为危害最严重的农业害虫之一。作为节肢动物中分布最广泛的细胞内共生细菌之一,Wolbachia可以在宿主中引起多种生殖异常现象,并调控宿主免疫和氧化还原等相关基因的表达,进而影响生物体对外源微生物入侵的抵御。自然界中的灰飞虱感染的Wolbachia株系是w Stri,该株系能诱导宿主产生强烈的胞质不亲和现象。然而,Wolbachia对灰飞虱免疫与氧化还原等方面的影响尚不清楚。本研究通过高通量测序技术、q RT-PCR技术和RNAi技术,明确了免疫与氧化还原等相关基因在感染和不感染Wolbachia两种灰飞虱品系之间的差异表达情况,以及免疫基因与Wolbachia密度之间的相关性;分析了两种灰飞虱品系在受到外源大肠杆菌感染后,免疫与氧化还原相关基因表达的变化情况;通过对两种灰飞虱品系的小RNA进行测序,分析响应Wolbachia感染的灰飞虱mi RNA潜在的作用。主要结果如下:1两种灰飞虱品系的转录组比较分析通过对感染和不感染Wolbachia的灰飞虱品系进行转录组测序分析,共获得了13.95 Gb clean data。对高质量的测序数据进行组装,共得到contig、transcript和unigene的总数分别为5,362,323、126,012和71,676,transcript与unigene的N50分别为2,287 bp和1,615 bp,其中长度在1kb以上的unigene有13,515条。与不感染Wolbachia的雄性灰飞虱相比,感染Wolbachia的雄性灰飞虱有560条基因上调,433条基因下调。对差异表达基因进行注释分析,结果表明,与免疫相关的基因在感染Wolbachia后发生了上调,包括防御素基因(defensin B,Ls Def-B)、黄嘌呤脱氢酶基因(xanthine dehydrogenase,Ls XDH)、漆酶2基因(laccase 2,Ls Lac-2)、转铁蛋白基因(transferrin,Ls Trf)、丝氨酸蛋白酶抑制剂B8基因(serpin-B8,Ls Spn-B8)、酚氧化酶原基因(prophenoloxidase,Lspro PO)、溶菌酶基因(i-type lysozyme6,Ls Lys i-6)、小分子热激蛋白基因(small heat shock protein,Ls Hsp20)、基质金属蛋白酶基因(Matrix metalloproteinase,Ls MMP)、丝氨酸蛋白酶基因(serine protease 4,Ls SP-4)。同时,一些与雄性生殖相关的基因在感染Wolbachia后发生了下调,包括精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3基因(testis-specific serine/threonine-protein kinase 3-like,Ls TSSK3)、精巢表达序列9蛋白基因(testis-expressed sequence 9 protein,Ls TEX9)、动力蛋白调节复合蛋白1基因(dynein regulatory complex protein 1,Ls DRC1)、外周致密纤维蛋白3基因(outer dense fiber protein 3-B-like,Ls ODF3B)。此外,Wolbachia引起7个涉及糖代谢基因的表达发生了变化。2 Wolbachia调节灰飞虱免疫与氧化还原相关基因的表达2.1 Wolbachia激活灰飞虱低日龄雄成虫、抑制低日龄雌成虫的免疫相关基因表达通过q RT-PCR检测,进一步分析了Wolbachia对不同日龄灰飞虱雌、雄成虫免疫相关基因表达的影响。结果表明,在雄成虫中,Wolbachia导致Lspro PO基因、Ls Spn-B8基因、Ls Lys i-6基因和Ls XDH基因的表达量在1-7日龄的雄成虫中以上调为主,而在9-15日龄期间以下调居多;Ls Lac-2基因在1-15日龄的雄成虫中均显著上调;Ls Def-B基因和Ls Trf基因的表达量在雄成虫3日龄和15日龄中上调,同时Ls Trf基因的表达量在7日龄和9日龄中上调,在11日龄和13日龄下调。在雌成虫中,Wolbachia导致Ls Lys i-6基因和Lspro PO基因的表达量既有上调又有下调,且1-7日龄主要表现出下调;Ls Spn-B8基因和Ls Trf基因的表达量在1-15日龄主要表现出显著下调;然而Ls Lac-2基因和Ls XDH基因的表达量在感染Wolbachia的灰飞虱雌成虫中整体表现出上调;此外,Ls Def-B基因的表达量变化较小。总体上来讲,Wolbachia激活灰飞虱雄成虫早期阶段体内免疫相关基因的表达,抑制灰飞虱雌成虫早期阶段体内免疫相关基因的表达。我们推测,灰飞虱雄成虫早期阶段免疫相关基因表达的升高可能与Wolbachia含量的增加有关,而灰飞虱雌成虫早期阶段免疫相关基因表达的降低可能与雌成虫维持其繁殖力有关。2.2 Wolbachia诱导灰飞虱免疫相关基因的上调与宿主NADPH氧化酶家族基因的上调有关通过检测Wolbachia诱导灰飞虱免疫基因上调的日龄中两种品系体内氧化还原相关基因表达水平的变化,分析了免疫基因上调与氧化还原相关基因变化之间的相关性。q RT-PCR结果显示,Wolbachia对3日龄雌成虫体内NADPH氧化酶基因的表达量没有影响,但Wolbachia导致3日龄雄成虫体内NADPH氧化酶基因Ls Nox4和Ls Nox5和抗氧化酶基因Ls SOD2和Ls POD2发生了显著上调。在11日龄中,Wolbachia引起雌成虫体内NADPH氧化酶基因Ls Nox5和Ls Duox和抗氧化酶基因Ls CAT和Ls SOD1显著上调。此外,Wolbachia导致11日龄雄成虫体内NADPH氧化酶基因Ls Nox4和Ls Duox和抗氧化酶基因Ls POD2基因显著上调。且感染Wolbachia的11日龄雌成虫体内NADPH氧化酶基因和抗氧化酶基因的上调程度高于相同日龄的雄成虫。暗示Wolbachia可能通过上调灰飞虱NADPH氧化酶家族基因的表达提升宿主体内的活性氧有水平,从而激活宿主免疫基因的表达。3沉默免疫相关基因导致灰飞虱雄成虫体内Wolbachia密度降低更显著利用RNA干扰技术,明确了灰飞虱雌成虫和雄成虫体内免疫相关基因下调对Wolbachia密度的影响。结果表明,干扰灰飞虱雌成虫体内免疫相关基因的表达后,仅在干扰Lspro PO基因后引起Wolbachia密度显著下降,而干扰Ls Def-B和Ls Lys i-6基因后Wolbachia密度也有一定程度的下降,但与对照相比差异不显著。干扰灰飞虱雄成虫体内免疫相关基因的表达后,Ls Def-B基因、Lspro PO基因、Ls Spn-B8基因和Ls Trf基因表达水平的下调均导致了Wolbachia密度的显著降低。4外源大肠杆菌侵染对两种灰飞虱品系死亡率的影响及免疫与氧化还原相关基因的表达分析4.1 Wolbachia影响灰飞虱在大肠杆菌侵染时的死亡率通过给两种灰飞虱品系饲喂含有大肠杆菌的人工饲料,然后计算校正死亡率。结果表明,取食含有大肠杆菌的人工饲料后,感染Wolbachia的2日龄、6日龄和10日龄雄成虫的校正死亡率分别为23%、39%和66%,不感染Wolbachia的2日龄、6日龄和10日龄雄成虫的校正死亡率分别为11%、24%和35%。表明感染Wolbachia的雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后的死亡率高于不感染Wolbachia的雄成虫,且随着试虫日龄的增加,两种灰飞虱品系雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后的死亡率升高。4.2 Wolbachia操纵灰飞虱在应对外源大肠杆菌侵染时的免疫基因表达通过检测两种灰飞虱品系不同日龄的雌成虫和雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后免疫相关基因的表达水平,分析两种灰飞虱品系感染外源细菌后死亡率存在差异的内在机制。结果显示,雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后,Ls Def-B基因的表达趋势在两种品系之间差异较大,两种品系Ls Lys i-6基因的表达量都上调,Ls Trf基因只在不感染Wolbachia的品系中上调,Ls Spn-B8基因、Ls Lac-2基因和Lspro PO基因几乎不响应大肠杆菌的侵染。雌成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后,两种品系免疫基因的表达整体上被抑制。Ls Trf基因的表达趋势在两种品系之间有明显的区别,Ls Trf基因在不感染Wolbachia的雌成虫中显著上调,在感染Wolbachia的雌成虫中显著下调。4.3 Wolbachia改变灰飞虱氧化还原系统对外源大肠杆菌侵染的敏感性通过检测两种灰飞虱品系不同日龄的雌成虫和雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后氧化还原相关基因的表达水平,进一步分析两种灰飞虱品系在感染外源细菌后死亡率存在差异的内在机制。结果表明,大肠杆菌侵染雄成虫后,感染Wolbachia品系2日龄的抗氧化酶基因都显著上调,同时,Ls Nox4基因和Ls Duox基因的表达量显著上调;不感染Wolbachia品系2日龄的抗氧化酶基因既有上调,也有下调,Ls Nox5基因显著上调。6日龄灰飞虱雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后,感染Wolbachia品系的大多数抗氧化酶基因都显著上调,不感染Wolbachia品系只有Ls CAT显著上调。10日龄灰飞虱雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后,感染Wolbachia品系的抗氧化酶基因大多数都显著下调,不感染Wolbachia品系有3个抗氧化酶基因上调。大肠杆菌侵染后,两种品系6日龄和10日龄雄成虫的NADPH氧化酶家族基因的表达都被抑制。2日龄雌成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后,不感染Wolbachia的品系中有更多的抗氧化酶基因的表达量上调。6日龄雌成虫取食含菌的人工饲料后,不感染Wolbachia的品系中有2个抗氧化酶基因的表达量显著下调。10日龄雌成虫取食含菌的人工饲料后,两种品系之间抗氧化酶基因上调和下调的数量相近。感染大肠杆菌后,两种灰飞虱品系雌成虫体内的NADPH氧化酶家族基因被诱导,且不感染Wolbachia品系中的NADPH氧化酶家族基因上调数量更多。暗示Wolbachia改变灰飞虱氧化还原系统在应对外源细菌侵染的敏感程度。5两种灰飞虱品系mi RNA的表达分析及靶基因预测通过高通量测序平台构建了四个s RNA文库(FUI、FI、MUI和MI),并分别获得16,616,711、26020481、23,702,808和22,471,936个clean reads。四个文库共鉴定到152个mi RNA,其中包括49个已知的mi RNA和103个新预测的mi RNA,共有104个mi RNA在四个文库中共享。Wolbachia导致灰飞虱雌成虫和雄成虫中51个mi RNA的表达水平发生了变化。与不感染Wolbachia的品系相比,Wolbachia导致雄成虫中18个mi RNA上调和6种mi RNA下调。在雌性中,Wolbachia引起25个mi RNA上调和15个mi RNA下调。而且,在雌性和雄性的比较组中共享13个差异表达的mi RNA。对差异表达mi RNA靶基因进行GO富集分析,结果表明,在雌性和雄性比较组中,预测到了参与immune system process、reproductive process、reproduction、developmental process、response to stimulus、antioxidant activity和growth等过程的靶基因。差异表达mi RNA的靶基因的KEGG注释分类结果显示,在雌性和雄性比较组中,富集到了涉及免疫(m TOR信号通路、Hippo信号通路、Jak-STAT信号通路、lysosome和peroxisome)、氧化还原(Hedgehog信号通路)以及sphingolipid metabolism和steroid biosynthesis等通路的靶基因。而通路如endocytosis、phagosome、aminoacyl-t RNA biosynthesis、carbon metabolism、amino sugar and nucleotide sugar metabolism、glycerolipid metabolism和insect hormone biosynthesis仅在雌性比较组中得到富集。同时,通路ether lipid metabolism、neuroactive ligand-receptor interaction、N-glycan biosynthesis、notch signaling pathway和selenocompound仅在雄性比较组中得到富集。同时,与雌性繁殖力有关的lst-mi R-n36-5p(靶卵黄蛋白原-6(Lsvg6)基因)和lst-mi R-n10-3p(靶核激素受体Fushi tarazu-factor1β(LsβFTZ-F1)基因)在感染Wolbachia的雌成虫中下调,然而,与雄性生育能力有关的lst-mi R-n13-5p(靶保幼激素酯酶(Ls JHE)基因)和lst-mi R-n81-5p(靶精子相关抗原6(Ls Spag6)基因)在感染Wolbachia的雄成虫中上调。而参与氧化还原的lst-mi R-n23-3p(靶线粒体锰超氧化物歧化酶(Lsm Mn SOD)基因)在感染Wolbachia的雌成虫中下调,lst-mi R-n47-5p(靶硫氧还蛋白还原酶(Ls Trx R)基因)在感染Wolbachia的雄成虫中上调。此外,与自噬有关的lst-mi R-n5-5p(靶雷帕霉素靶蛋白(Ls TOR)基因)和与黑化反应有关的lst-mi R-n52-5p(靶储存蛋白hexamerin(Ls Hex)基因)在感染Wolbachia的雌性和雄性灰飞虱中都被下调。综合上述结果表明,Wolbachia激活了灰飞虱雄成虫早期阶段体内免疫相关基因的表达,抑制了灰飞虱雌成虫早期阶段体内免疫相关基因的表达。灰飞虱体内免疫相关基因表达的下调会导致Wolbachia密度降低,这种相关性在雄成虫中表现的更为密切。在外源大肠杆菌入侵时,Wolbachia阻制了灰飞虱体内Ls Trf基因的上调表达,并导致灰飞虱雄成虫体内氧化还原的平衡受损更严重,从而使得感染Wolbachia的雄成虫取食含有大肠杆菌的人工饲料后的死亡率高于不感染Wolbachia的雄成虫。同时,Wolbachia通过调控灰飞虱体内mi RNA的表达,进一步调节灰飞虱体内免疫与氧化还原基因的表达水平。研究结果不仅有助于揭示Wolbachia与灰飞虱互作的分子机制,也为进一步利用Wolbachia在昆虫中的生物防治研究提供了理论基础。