细胞内蛋白质核磁共振波谱(In-cell Protein NMR Spectroscopy)能够提供细胞中蛋白质原子水平分辨的构象及功能信息。然而,细胞内高浓度的生物大分子和环境的复杂不均一性使得NMR技术在细胞内蛋白质的研究中充满挑战。本文主要发展19F NMR方法研究活细胞内蛋白质的构象、动态以及弱相互作用并对细胞内蛋白质的共振信号增宽问题进行分析。具体内容如下：1.发展和完善适合细胞内NMR研究的蛋白质标记方法与策略。通过对多种蛋白质分别进行15N,13C,2H以及19F标记,采集相应的细胞内以及稀溶液中的核磁图谱。经比较分析,发现相比15N标记,15N、2H双标记使得细胞内的15N-’H HSQC谱图质量获得一定改善；不同于原核大肠杆菌,真核卵母细胞的13C甲基区域背景信号极强,对目的信号存在严重干扰；19F标记由于低背景干扰,适用于细胞内大分子量的蛋白质研究,可以发展成为适合原核细胞和真核细胞中NMR研究的蛋白质普适性标记方法。2.阐明细胞内蛋白质的核磁信号增宽机制。蛋白质在细胞内的核磁信号严重增宽,可能源于细胞内的粘度、蛋白质弱相互作用以及磁不均一性的贡献。在此,我们发展19F NMR方法区分并定量分析了这三部分的贡献。发现不同细胞内蛋白质信号增宽的主要机制并不一样：原核大肠杆菌内主要来自粘度以及弱相互作用的影响,而在真核卵母细胞内则主要来自弱相互作用和磁不均一性的影响。另外,发现细胞内蛋白质转动扩散的尺寸效应源于弱相互作用。3.细胞内钙调蛋白激活机制的19F NMR研究。钙离子(Ca2+)介导钙调蛋白(CaM)构象的转变是许多信号传导路径中的关键环节。已有观点认为细胞内信号传导途径的激活受不同Ca2+浓度下CaM与不同目标物的相对结合力的调控。然而,细胞内CaM的构象变化、结合力以及结构是否与体外研究的结果一致仍有待验证。我们利用19F NMR方法直接观测完整卵母细胞内Ca2+诱导的CaM构象转变,并对不同Ca2+浓度水平下钙离子游离态和结合态进行定量分析。结果显示,在较低的Ca2+浓度下,相比CaM,结合MLCK (myosin light chain kinase)多肽的CaM复合物与Ca2+的结合力较高,说明细胞内MLCK可以在较低的Ca2+浓度下被激活,进而实现下游信号传导。我们还首次实现了细胞内蛋白质的19F赝接触位移(Pseudocontact shift, PCS)技术,可以用来获取细胞内蛋白质的长程结构约束信息。19F NMR方法在此对CaM的研究可以考虑推广到对活细胞内其它信号传导系统的研究。此外,我们还对细胞内α-突触核蛋白(SYN)及其磷酸化修饰的生理效应和人体细胞内目的蛋白质的富集方法进行了初步的探索。总之,我们发展了19F NMR方法适用于不同细胞内包括球形蛋白以及无结构蛋白的研究,定量表征了细胞内的粘度、蛋白质弱相互作用以及磁不均一性对细胞内蛋白质共振信号线宽的贡献,并发现细胞内蛋白质转动扩散的尺寸效应源于弱相互作用。利用发展的19F NMR方法,我们证实了细胞内CaM的激活机制,并首次将19F PCS应用于细胞内蛋白质的结构解析,推测CaM与下游蛋白MLCK形成的复合物在细胞内和稀溶液中具有类似的结构。另外,利用细胞内核磁共振技术我们的初步研究结果表明SYN及其磷酸化修饰在细胞内具有不同的生理效应。