目的：　　采用药物罗丹明6G(Rhodamine6G，R6G)和溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)分别处理小鼠胰腺β细胞MIN6细胞，使线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数出现不同程度的下降，研究MIN6细胞中mtDNA拷贝数的下降对胰岛素分泌功能的影响并分析mtDNA拷贝数下降引起胰岛素分泌功能改变的临界值。探讨mtDNA和线粒体呼吸功能对于葡萄糖刺激产生的胞内游离钙离子含量增加和胰岛素分泌增加的重要性。　　方法：　　1.本研究采用小鼠胰腺β细胞株MIN6细胞，其保留有对细胞外葡萄糖浓度刺激产生反应的胰岛素分泌表型。通过药物R6G和EB各自处理MIN6细胞，Knockdown mtDNA，从而使MIN6细胞中的mtDNA拷贝数下降。mtDNA减少的细胞具有一定程度的嘧啶依赖性和丙酮酸盐-依赖性，因此药物处理后的MIN6细胞需要添加辅源营养物质（尿嘧啶和丙酮酸盐），通过测定对辅源营养物质依赖性来初步鉴定MIN6细胞中mtDNA含量减少，并分析细胞中mtDNA水平减少的程度。　　2.提取细胞全基因组DNA，PCR扩增mtDNA任意片段，通过PCR分析进一步检测mtDNA的减少。　　3.通过real time PCR比较CT法（Comparative Delta-Delta Ct法，△△CT法）对正常MIN6细胞和药物处理的细胞中的mtDNA拷贝数进行比较，检测药物处理后mtDNA拷贝数是否减少以及拷贝数下降的比例。　　4.采用胰岛素放射免疫测定法进行正常MIN6细胞、R6G作用MIN6细胞、EB作用MIN6细胞的葡萄糖刺激胰岛素释放(GSIS)试验，根据数据绘制出不同葡萄糖浓度下的胰岛素分泌曲线。并对结果进行比较。　　5.通过激光共聚焦显微镜测定正常MIN6细胞、R6G作用MIN6细胞、EB作用MIN6细胞内的游离Ca2+浓度。根据定性的结果比较三种细胞的胞内游离Ca2+浓度的差异，并通过动态观察MIN6细胞内游离钙离子对葡萄糖刺激产生的反应来验证mtDNA拷贝数的下降对胰岛素分泌能力的影响。　　结果：　　1.根据对药物作用浓度以及作用时间摸索的多次重复实验，对药物选择合适的作用浓度和时间。两种药物处理后的细胞在辅源营养物质组和普通培养基组并无差异。并未表现出嘧啶依赖性和丙酮酸盐依赖性。提示MIN6细胞中包含有残存的mtDNA，仍然可起到代偿作用。　　2.PCR产物电泳结果显示正常MIN6细胞和两种药物分别作用的细胞均出现目的条带，从而提示两种药物分别作用的细胞中还存在有mtDNA或是mtDNA片断。Real time PCR结果显示药物处理后的细胞中mtDNA拷贝数均有下降，拷贝数减少量并不显著，并且mtDNA拷贝数减少量受药物浓度与作用时间的综合影响。GSIS实验结果显示药物作用后的细胞的胰岛素基础分泌量低于正常MIN6细胞，正常MIN6细胞胰岛素的分泌量随葡萄糖浓度增加而增加，而R6G作用细胞和EB作用细胞胰岛素分泌量增加幅度小，甚至R6G作用细胞还出现葡萄糖浓度增加胰岛素分泌量反而减少的现象。但是并未发现mtDNA拷贝数与胰岛素分泌量之间存在明显的数量之间的相关性，但是mtDNA减少量越大，对细胞的功能影响势必越显著。　　3.动态观测葡萄糖刺激引起的正常MIN6细胞、R6G作用细胞以及EB作用细胞的胞内游离钙离子浓度的变化发现，葡萄糖浓度提高后，正常MIN6细胞反应快而且明显，胞内游离钙离子含量大幅增加，而R6G作用细胞增加稍有滞后，且增加幅度小;EB作用细胞则未能观察到具有规律性的改变。　　结论：　　本实验采用去mtDNA药物R6G和EB处理MIN6细胞，Knock down MIN6细胞中的mtDNA，通过比较CT法的结果分析显示出mtDNA拷贝数的下降。从胰岛素分泌功能的相关结果显示了mtDNA拷贝数下降对葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌和钙离子内流有一定的抑制作用。　　上述结果显示无论R6G作用细胞还是EB作用细胞，Knock down mtDNA后，mtDNA拷贝数都有一定程度的减少，但是并未完全缺失，仍然存在一定水平的mtDNA。由于mtDNA拷贝数的减少，导致线粒体功能出现一定程度的缺陷，从而影响了MIN6细胞的胰岛素分泌功能。而由于mtDNA拷贝数下降的程度不同以及剩余的mtDNA代偿作用的不同，使得胰岛素分泌功能所受的抑制效果也存在差异。　　文献报道，基于还不明确的原因，鼠类来源的细胞株，对EB作用耐受，作用一段时间后对EB产生“耐药性”。在去除细胞中的线粒体成分方面，R6G的作用效果则优于EB。因此在后继的构建异质性mtDNA突变功能研究的细胞模型中，考虑主要采用R6G作为去mtDNA的药物来制备mtDNA的受体细胞。　　此外，本实验的结果支持了葡萄糖-信号假说，并发现在葡萄糖刺激胰岛素分泌的过程中，β细胞内钙离子的变化与胰岛素释放密切相关。这为后续的研究mtDNA异质性突变致线粒体功能改变与糖尿病发生发展等相关性的研究提供了前期的理论依据。