研究背景与目的:人类大脑中有数百亿个神经元和胶质细胞;除小胶质细胞外,这些细胞都由胚胎神经管中的神经上皮细胞分裂与分化而来。在皮质发育过程中,大脑皮层靠近脑室侧的神经干细胞完成不对称分裂,在维持神经干细胞的数量的同时产生新生神经元;新生的神经元经历有序的迁移,最终形成大脑皮质中兴奋性神经元有序的分层结构;除此之外,大部分中间神经元由神经节隆起中的前体细胞发育并横向迁移而来。中枢神经系统,尤其是具有高级神经功能的大脑皮层正确、有序的发育对正常的神经功能十分重要;任何影响神经干细胞增殖、分化和影响神经元迁移与分层分布的因素都有可能导致神经发育障碍疾病。原发性遗传性小头畸形是一种以头围减小为显著表现的神经发育障碍疾病。患者的头围异常由遗传因素引起,在出生时就已显现;随着患者年龄增长,头围的异常更加显著,并出现不同程度的智能障碍。目前已经发现的原发性遗传性小头畸形的致病基因已经有28个,它们的功能包括调控中心粒的生物发生、对纺锤体的动态调控、细胞周期调控、DNA损伤修复和Wnt信号通路传导等;但仍有相当一部分原发性遗传性小头畸形患者的致病基因尚不明确。对于小头畸形致病新基因的发掘和其致病机制的研究可以帮助我们了解正常神经系统发育过程中复杂的机制和调节系统,并将有望据此设计出可行的致病基因突变筛查方法,避免新的患儿出生。据此,本课题从临床信息、体外实验和体内实验三方面,对ATP6V0A2基因突变对小头畸形的致病作用和致病机制进行研究。研究方法与结果:1.小头畸形家系中ATP6V0A2突变的发现:原发性遗传性小头畸形具有基因致病和病例家族聚集性出现的特点,因此通过高通量测序技术收集原发性遗传性小头畸形家系内患者的遗传信息,利用生物信息学方法对基因信息进行处理和筛选、最终得到潜在致病基因的研究方案是可行的。结合实地调查、全外显子测序和Sanger测序技术,我们在原发性遗传性小头畸形发病率相对较高的巴基斯坦的2个原发性遗传性小头畸形的家系内的3名患者中发现了ATP6V0A2c.410C＞T的纯合错义突变,且符合家系共分离。患者具有显著的头围减小和智能障碍等典型的小头畸形的临床表现。MRI检查显示患者胼胝体、脑室等其他结构正常。2.ATP6V0A2 c.410C＞T突变的生物学意义:ATP6V0A2 c.410C＞T是一个错义突变,引起ATP6V0A2蛋白质的137号苏氨酸突变为异亮氨酸。为了研究ATP6V0A2 c.410C＞T是否具有生物学意义,我们使用在细胞内分别过表达带标签的野生型和突变型ATP6V0A2的方法研究其蛋白质的表达水平、转录水平、蛋白质稳定性和蛋白质在细胞内的定位。研究发现,ATP6V0A2 c.410C＞T突变导致蛋白质稳定性降低,但不影响ATP6V0A2的转录和蛋白质的细胞内定位,提示ATP6V0A2 c.410C＞T是一个功能缺失突变。ATP6V0A2是V型ATP酶的一个亚基;敲低ATP6V0A2显著提高了细胞高尔基体和内吞体/溶酶体的p H值,提示ATP6V0A2参与高尔基体和内吞体/溶酶体的酸化过程,但对高尔基体对蛋白的N糖基化和O糖基化修饰作用及细胞自噬水平没有影响。3.ATP6V0A2对神经系统发育的影响:ATP6V0A2在小鼠胚胎脑内高度表达,提示其可能在大脑发育中发挥作用。我们使用胚胎电转染技术在小鼠胚胎发育的皮质中敲低ATP6V0A2的水平来研究其对神经系统发育的影响。敲低ATP6V0A2使迁移过程中的神经元不能建立正确极性,并因无法完成多级-双级形态转换滞留在中间层,无法向皮质板层迁移。敲低ATP6V0A2不影响神经干细胞的数量、神经元迁移骨架系统和神经元的分化,也不引起神经元凋亡。结论:综上所述,本研究在原发性家族性小头畸形的家系中发现患者纯合携带ATP6V0A2的功能缺失突变c.410C＞T,与小头畸形相关。ATP6V0A2作为V型ATP酶的一个亚基参与高尔基体和内吞体/溶酶体的酸化过程。在神经系统发育过程中敲低ATP6V0A2影响神经元的迁移过程,引起神经发育障碍。本研究拓展了我们对ATP6V0A2功能的认识,尤其是其对神经系统发育的影响。