研究背景CD99 antigen-like 2(CD99L2)是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白,不属于任何已知的蛋白家族。CD99L2蛋白分布广泛,在人和小鼠多种器官都有高表达。血液血管系统主要表达在血管内皮细胞、白细胞和淋巴细胞细胞膜上,但在不同细胞表达水平有差异。虽然CD99L2在内皮细胞与白细胞上都有表达,但是只有内皮细胞上的CD99L2在白细胞外渗过程中起决定性作用。在各种小鼠炎症条件下,CD99L2表达降低或者缺失,炎症病灶部位招募到的炎细胞数目都有40%-80%左右的减少。因此,CD99L2 对于炎症反应的正常白细胞外渗必不可少。CD99L2在炎细胞外渗过程中的许多机制仍不清楚,亟待进一步深入研究;CD99L2蛋白在血管内皮细胞、白细胞和淋巴细胞细胞膜上有表达,是否影响造血发育仍不清楚,亟待进一步深入研究;鼠源性CD99L2与B细胞淋巴瘤发生相关,然而CD99L2在B细胞淋巴瘤的形成过程中扮演怎样角色仍不清楚,亟待进一步深入研究。为了研究这些问题,我们选择斑马鱼这种模式生物来进一步研究。斑马鱼(zebrafish;Daniorerio),原产于印度、孟加拉国等地区,属脊椎动物亚门、辐鳍鱼纲、鲤形目、鲤科,是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细,成鱼体长3～4cm,性成熟期约3个月,寿命约为2～3年。斑马鱼用于研究主要是因为以下方面:1.养殖方便,斑马鱼个体小可以高密度饲养,养殖花费;2.繁殖力强,斑马鱼的繁殖周期约7天左右,每周可产卵300余枚;3.体外授精且发育周期短,受精后36小时左右,斑马鱼主要器官原基都形成,3个月即性成熟可繁衍后代;4.胚胎透明,斑马鱼体外授精,胚胎发育早期通体透明,易于观察;5.斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%,其在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发生机制等方面均表现的与人类高度一致。近年来,斑马鱼作为模式生物的应用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统(例如,神经系统、心血管系统、免疫系统等)的发育、功能和疾病的研究中,并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。特别是斑马鱼可以进行大规模的基因突变与筛选,这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。因此基因敲除技术构建cd99l2基因敲除的斑马鱼模型有助于进一步研究。目前常用的有两种基因编辑技术:类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)。这两种编辑技术主要依赖于一些识别特定序列的核酸酶在DNA上切割,造成双链DNA断裂,然后启动非同源末端连接(non-homologousend joining,NHEJ)或同源重组(homologous recombination)来修复 DNA,与此同时,对DNA断点附近的序列进行编辑。非同源末端连接修复机制可以直接将两个DNA断端彼此连接在一起,在修复过程中容易产生插入或缺失突变。同源重组修复发生概率较低,但由于该机制在修复的过程中有同源链作为模板,因此可以实现精确的突变。这两种修复机制会产生两者突变类型:(1)造成移码突变,会使基因的功能遭到破坏,从而实现基因的敲除;(2)删除或插入的DNA片段的碱基数正好是3的整数倍,则在蛋白水平上导致氨基酸残基的缺失或增加,对蛋白的功能有影响的可能性较低。TALEN与CRISPR/Cas这两种基因编辑技术原理简单,易于推广应用,但是各有其优劣。从技术操作性来看,CRISPR/Cas系统相对简单,切割效率高,易于同时对基因组的多个位点进行切割和修饰。从靶点识别结合特异性来说,TALEN要比CRISPR/Cas系统更好,其脱靶概率更低。本研究选择TALEN技术构建斑马鱼cd99l2基因敲除模型。TALEN是由DNA识别结合结构域(TALE)与酶促切割结构域(FOKI)组合而成的融合蛋白,可靶向结合特异DNA序列,造成DNA双链断裂,启动修复,产生插入或缺失突变。因此,我们采用了 TALEN技术靶向敲除斑马鱼cd99l2基因。此外,我们还在筛选到的突变体cd99l2smu40中,初步检测了其造血发育的表型。斑马鱼中的造血过程与哺乳动物十分相似:(l)造血过程相似;(2)具有相似的造血区域:(3)信号通路方面也比较相似。因此斑马鱼非常适合用于研究早期胚胎造血。斑马鱼的造血过程分为原始造血和定向造血两个阶段。原始造血的主要作用是产生能够为机体提供氧气的红细胞,以满足早期胚胎快速生长的需要。定向造血出现在发育阶段的晚些时期,其显著特点是随着发育时间的改变,其位置也发生相应的变化。定向造血阶段生成造血干细胞,它具有多能性,能够分化产生机体所需的全部谱系的血细胞。由腹侧中胚层形成的中央细胞群是产生原始红系祖细胞的组织,而前部侧向中胚层被认为是原始髓系造血的位点。在受精后30h,在背主动脉腹侧壁区域开始产生造血干细胞,标志着定向造血阶段的开始,这些造血干细胞随后逐渐迁移至尾部造血组织,最后定居在肾脏,为机体终生造血。造血发育是一个复杂有序的动态过程,受到多个转录因子的调控。原始造血过程主要由Gata1和Pu.1两个调控因子所调控,它们之间呈现出相互拮抗的关系,共同调节原始红系和髓系的命运分化。其中Gata1标记原始红系造血,而Pu.1则标记原始髓系造血。在定向造血阶段主要的调控因子有Runx1和Cmyb等,它们同时也是造血干细胞的标记物。此外,其他的造血发育阶段标记基因还包括标记定向红系造血的αe1和βe1,标记定向髓系造血的lcp1,特异性标记中性粒细胞的mpx和lyz,特异性标记巨噬细胞的mfap4和mpeg1,以及标记定向淋系造血的gata3、ikaros、rag1和rag2等。本研究研究内容总共分为三个部分:第一部分为斑马鱼靶向cd99l2基因的TALEN质粒的构建;第二部分为斑马鱼cd99l2基因敲除模型验证筛选;第三部分为斑马鱼cd99l2突变体造血表型初步鉴定。第一部分:斑马鱼靶向cdd99l2基因的TALEN质粒的构建1.目的人工构建针对斑马鱼cd99l2基因第一外显子的重组核酸酶TALEN,在体内对特定靶位点产生切割造成DNA双链断裂,利用机体自身DNA损伤后的同源重组和非同源末端修复引入基因突变、敲除或敲入,实现基因定点修饰的目的,建立斑马鱼cd99l2基因敲除的动物模型。2.方法利用生物信息学网站分析斑马鱼cd99l2基因序列与编码序列,针对第一外显子设计一对靶点。TALEN表达载体完成后通过测序验证TALEN是否载体是否正确。线性化TALEN表达载体DNA,使用SP6体外转录试剂盒将其转录成mRNAs。通通过显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期受精卵中,酶切法检测TALEN的体内活性。2.结果测序结果证实成功地构建出了正确的针对cd99l2的第一外显子左、右半位点的重组核酸酶,TALENs体内效率约82%。4.结论成功构建cd99l2基因敲除的斑马鱼模型,为进一步研究人类炎症反应机制及治疗研究提供了良好的动物模型。第二部分:斑马鱼cd99l2基因敲除模型验证筛选1.目的对TALEN造成的各种cd99l2斑马鱼的突变进行筛选,验证斑马鱼cd99l2基因敲除模型的成功与否。2.方法待注射的斑马鱼性成熟后,与野生型斑马鱼外交得到F1代胚胎,以筛选出突变可以遗传给后代F0代成鱼。饲养由筛选出的F0成鱼外交得到的Fi代。通过逐条剪尾、酶切检测发生基因突变的F1代斑马鱼,测序确认突变体的基因型,筛选出cd99l2基因敲除的斑马鱼。通过QF-PCR的方法检测突变体内cd99l2 mRNA的表达水平,确认基因敲除是否成功。2.结果通过逐条剪尾、PCR、酶切法检测成功地筛选出了 12种靶点发生突变的斑马鱼,测序结果显示斑马鱼突变体产生了不同片段大小、不同位置的cd99l2基因敲除。其中cd99l2smu40突变体cd99l2mRNA明显降低,敲除模型构建成功。4.结论成功构建cd99l2基因敲除的斑马鱼模型,为进一步研究人类炎症反应机制及治疗研究提供了良好的动物模型。第三部分:斑马鱼cd99l2突变体造血表型初步鉴定1.目的对TALEN造成cd99l2斑马鱼的突变体cd99l2smu40进行造血表型初步鉴定2.方法我们运用QF-PCR的方法检测cd99l2smu40突变体中各谱系造血的代表性标记基因的表达,分别是:标记原始髓系造血的pu.1,标记原始红系造血的gata1和βe1,标记定向造血干细胞的c-myb和runx1,标记中性粒细胞的lyz和mpx,标记巨噬细胞的mfap4,标记定向红系造血的βe1,标记定向淋系造血的rag1。我们运用原位杂交的方法检测标记红系造血发育的基因βe1的表达。同时为了检测巨噬细胞与粒细胞的功能与发育,我们分别运用NR染色和SB染色。3.结果我们分别检测了各谱系造血的代表性标记基因在cd99l2smu40中的表达,结果显示这些标记基因在cd99l2smu40中均能正常表达,提示突变体cd99l2smu40的各个谱系造血发育基本正常。同时特别运用NR染色和SB染色检测了中性粒细胞和巨噬细胞功能,结果证明中性粒细胞和巨噬细胞的功能未受影响。4.结论斑马鱼cd99l2smu40突变体各谱系造血发育基本正常。