RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链小干扰RNA分子(small interfering RNAs，siRNAs)介导，在转录后水平上通过碱基配对而进行的序列特异性基因沉默的过程。该技术已被广泛应用于研究和治疗人类重大疾病。随着RNAi技术在生命领域的应用，microRNA(miRNA)引起人们极大的兴趣。近年的研究证实miRNA在肿瘤等重大疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用。人们还发现机体存在多种miRNA簇，即一个启动子调控表达多个相连的miRNAs，然后被切割为具有独立活性的miRNAs并作用于不同的基因。参照miRNA簇骨架设计的shRNAs可剪切出有效的siRNAs并明显提高基因沉默的效率。然而，如何将siRNAs高效的运载到机体的特定部位对人们来说仍是个挑战，科学家们研究发现腺病毒具有独特的优点，是携带表达siRNAs的合适的载体。　　 EZH2和BMI1基因均为PcG(polycomb group，PcG)家族成员，是进化高度保守的癌基因，并在肝癌中高表达。因此，通过抑制该基因表达可有效的抑制肝癌细胞的增殖，达到治疗肝癌的目的。　　 目标：人们对机体许多重大疾病发生的原因共识为：该类疾病的发生并不是单基因突变所导致的，往往由于多基因的异常而诱发。为此，我们利用RNAi技术，构建能携带miRNA簇的腺病毒载体，并同时表达出多个有效的siRNAs下调EZH2和BMI1基因的表达，为治疗多基因疾病和多基因功能的研究提供良好的平台。　　 方法：本课题模拟miR-30簇结构而设计干扰EZH2和BMI1基因表达的siRNAs。将该miR-30簇克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中，通过腺病毒质粒pAdeasy-1与穿梭质粒pShuttle-CMV在E.coliBJ5183菌株中同源重组，得到在同一启动子下启动表达产生靶向不同基因的siRNAs的腺病毒骨架质粒，进一步在HEK293中包装为目的病毒。经鉴定正确并扩增纯化后，通过Western Blot实验观察其是否抑制EZH2和BMI1蛋白的表达，并通过MTT实验考察了抑制EZH2和BMI1蛋白对肝癌细胞增殖作用的影响。　　 结果：成功构建腺病毒Ad-siE，Ad-siB和Ad-siEB。体外实验表明，Ad-siE，Ad-siB分别抑制EZH2、BMI1蛋白的表达，更重要的是Ad-siEB能同时抑制EZH2和BMI1蛋白的表达，同时它们都显著抑制肝癌细胞的增殖。　　 结论：本文通过在E.coliBJ5183菌株中重组、HEK293细胞中包装生产腺病毒的方法，成功得到能表达miR-30簇并剪切成为有效siRNAs的腺病毒。实验结果表明：Ad-siE、Ad-siB和Ad-siEB可表达miR-30并产生siRNAs，并分别抑制肝癌细胞中目的蛋白EZH2或(和)BMI1的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖。本研究为治疗肝癌等人类重大疾病带来新的希望，同时为多基因功能研究提供的新的策略。