抑郁症是一种常见的、具有较严重危害的、易复发的精神类疾病,且随抑郁症病情加重患者可出现自杀倾向。目前,抑郁症的发病机理仍不十分清楚,安全有效临床治疗抑郁药物相对匮乏。因此,探索抑郁症病理机制与发现新的抗抑郁药物至关重要。抑郁症患者常伴随着中枢神经炎症的发生。抑郁症患者尸检结果显示其脑皮层、海马等功能区小胶质细胞呈现活化状态,星形胶质细胞数量和密度减少并伴随功能失调,这些观察结果可显示抑郁症末期机体生理病理指标,但可能不能很好地解释抑郁症患者初期中枢神经炎症产生与机体免疫炎症变化。在中枢神经系统中,星形胶质细胞也可产生并分泌神经炎性细胞因子与趋化因子,可调节中枢免疫,如星形胶质细胞活化加重了阿尔兹海默症中枢神经炎症,但其在抑郁症中枢神经炎症中扮演的角色亟需探索。慢性应激是诱发抑郁症的重要因素之一,它可激活神经-内分泌中枢下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴),导致糖皮质激素持续升高。本课题组前期工作已观察到慢性不可预见温和应激(CUMS)刺激大鼠12周后,脑功能区前额叶皮层炎性细胞因子IL-1β蛋白成熟、神经炎症发生以及星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达降低等。为进一步探索星形胶质细胞在慢性应激刺激初期可能引起的免疫调节变化,本文选用应激水平的糖皮质激素(皮质酮)体外处理星形胶质细胞,以模拟抑郁症初期星形胶质细胞状态,探索星形胶质细胞是否发生以IL-1β成熟为特征的免疫炎性改变及其可能存在的机制,在此基础上,分析中药成分是否可具有调控作用,以期发现其抗抑郁可能的作用途径。正常人血清皮质醇浓度在137-283 nM范围内。文献报道应激状态下大鼠海马游离皮质酮水平27ng/mL(约80nM)。因此,本文选用终浓度100nM皮质酮处理原代分离并纯化培养SD大鼠星形胶质细胞,24、48和72 h后检测细胞内白细胞介素1β(IL-1β)基因和蛋白的变化。与正常组比较,IL-1β基因与总蛋白水平未产生统计学显著性变化,但IL-1β成熟体表达水平显著增加(p<0.05)。进一步检测胞内NOD样受体蛋白3(NLRP3)和蛋白半胱天冬酶-1(Caspase-1)表达,结果发现星形胶质细胞在100 nM皮质酮处理后NLRP3(p<0.01)和成熟体Caspase-1(p<0.001)蛋白水平显著升高,提示应激水平皮质酮可诱导星形胶质细胞发生以NLRP3炎症小体激活介导IL-1β成熟为特征的免疫炎性改变。本课题组前期工作证实,硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)参与诱导NLRP3炎症小体激活以及IL-1β蛋白成熟。在本文研究中观察到原代培养大鼠星形胶质细胞经皮质酮处理72h后,细胞内TXNIP蛋白显著升高(p<0.001)。TXNIP作为细胞内硫氧还蛋白(TRX)内源性抑制因子,可通过调节TRX活性影响TRX系统对细胞内活性氧的清除。细胞内过表达TXNIP可通过抑制硫氧还蛋白-1(TRX-1)活性,促进细胞内活性氧簇(ROS)累积以激活NLRP3炎症小体和IL-1β蛋白剪切成熟。本文也检测到100 nM皮质酮所处理72 h的原代星形胶质细胞内TRX-1蛋白水平显著降低(p<0.001)与ROS水平显著升高(p<0.001)。有研究证实TXNIP表达可能受糖皮质激素转录调控影响。因此,本文对100nM皮质酮处理的原代SD大鼠星形胶质细胞TXTVIP基因表达进行检测,发现皮质酮处理72 h后,细胞内TXNIP基因表达显著性升高(p<0.001),约为正常组表达水平的2倍。这些研究结果提示应激水平皮质酮可通过上调原代大鼠星形胶质细胞TXNIP基因与蛋白水平、下调TRX-1蛋白水平,促使细胞内ROS累积,引起了以NLRP3炎症小体激活介导IL-1β蛋白剪切成熟的免疫炎性改变。另外,本文在小鼠C8-D1A星形胶质细胞上进行研究。结果发现,100 nM皮质酮处理小鼠C8-D1A细胞72 h后,细胞内IL-1β基因与总蛋白水平也未显著性变化,其成熟体蛋白水平显著增加(p<0.001),NLRP3(p<0.01)与成熟体Caspase-1(p<0.001)蛋白水平也显著性升高。另外,该模型细胞内TXNIP基因和蛋白表达水平显著增加(p<0.01、p<0.001),但TRX-1蛋白水平显著降低(p<0.01),同时活性氧水平显著增加(p<0.001)与SD大鼠原代星形胶质细胞上观察到的结果相一致。这些研究结果提示应激水平皮质酮同样可通过上调小鼠C8-D1A细胞TXNIP基因和蛋白表达、下调TRX-1蛋白水平,促使细胞内ROS累积,引起以NLRP3炎症小体激活介导IL-1β蛋白剪切成熟为特征的免疫炎性改变。本文使用C57BL/6小鼠进行在体研究,皮质酮(20mg/kg)皮下注射连续三周,盐酸氟西汀(10mg/kg)以灌胃方式,连续给药三周。使用Western blot方法检测到皮质酮模型小鼠皮层星形胶质细胞TXNIP蛋白过表达(p<0.001)、TRX-1蛋白低表达(p<0.01),NLRP3与成熟体Caspase-1蛋白高表达(p<0.001),以及IL-1β蛋白剪切成熟(p<0.01),以及这些效应被氟西汀所逆转,具体表现在降低模型动物皮层星形胶质细胞TXNIP(p<0.001),上调TRX-1(p<0.001),抑制NLRP3炎症小体激活与IL-1β蛋白成熟(p<0.01)。由于星形胶质细胞的活化可以促使细胞免疫炎性因子的成熟释放,在皮质酮模型小鼠上已经观察到皮层星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达降低,同时也发现100 nM皮质酮处理72 h后,原代培养SD大鼠星形胶质细胞内GFAP蛋白过表达,提示该模型下原代大鼠星形胶质细胞处于活化状态。一般认为,星形胶质细胞可通过糖酵解途径将所摄取的葡萄糖代谢为乳酸,并将其分泌到胞外为神经元提供能量,而TXNIP蛋白对细胞葡萄糖摄取起到了负调控作用,但在应激水平下细胞内糖酵解功能是否受到影响?因此,本文初步研究了皮质酮对原代大鼠星形胶质细胞糖酵解产物胞外乳酸水平以及糖酵解关键酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)基因表达的影响,研究结果发现100nM皮质酮处理72 h可显著降低原代大鼠星形胶质细胞胞外乳酸水平(p<0.01)以及胞内糖酵解关键酶PFKFB3基因表达水平(p<0.01)。这些实验结果表明应激水平皮质酮可以引起原代星形胶质细胞胞外乳酸分泌降低及糖酵解关键酶基因下调。提示应激水平皮质酮可能使原代星形胶质细胞激活并促进细胞糖酵解代谢失衡。淫羊藿黄酮类成分、二苯乙烯类成分和姜黄素等均具有抗炎、抗氧化、神经保护等功能。但这些中药成分能否逆转应激水平皮质酮所诱导的原代大鼠星形胶质细胞——IL-1β成熟增加仍不可知。为筛选可抑制皮质酮所引起星形胶质细胞免疫炎性的有效中药活性成分,本文在上述应激水平皮质酮所诱导NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟为特征的免疫炎性改变细胞星形胶质模型上,分析白藜芦醇、紫檀茋、桑皮苷A、姜黄素、虎杖苷、淫羊藿苷、宝藿苷I、淫羊藿素、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等11种中药成分可能的作用,实验结果显示淫羊藿苷(2.5、5、10和20 μM)和宝藿苷Ⅰ(2.5、5、10和20 μM)对模型细胞TXNIP过表达有显著逆转作用,且具有较好量效关系。淫羊藿苷(5、10和20 μM)和宝藿苷Ⅰ(5、10和20 μM)可显著下调模型细胞TXNIP蛋白水平,上调TRX-1蛋白水平,并降低胞内总ROS水平,同时抑制NLRP3炎症小体的激活以及IL-1β剪切成熟。虽然白藜芦醇(10、20和40 μM)、紫檀茋(2.5、5和10μM)和桑皮苷A(5、10和20 μM)对该模型细胞TXNIP高表达无显著抑制作用,但白藜芦醇、紫檀茋和桑皮苷A可显著降低皮质酮所引起原代SD大鼠星形胶质细胞胞内总ROS,并抑制NLRP3炎性小体的激活以及IL-1β成熟。这些实验结果表明淫羊藿苷与宝藿苷I可下调模型细胞TXNIP基因与蛋白表达,而白藜芦醇、紫檀茋和桑皮苷A则可降低模型细胞胞内总ROS,从而逆转应激水平皮质酮所诱导的以NLRP3炎症小体激活介导IL-1β成熟为特征的星形胶质细胞免疫炎性改变。提示淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、白藜芦醇、紫檀茋和桑皮苷A等中药成分可能通过不同的作用途径,保护应激激素诱导免疫炎性改变的星形胶质细胞。小结:应激水平皮质酮可诱导原代SD大鼠星形胶质细胞与C8-D1A细胞发生以NLRP3炎症小体激活介导IL-1β成熟为特征的免疫炎性改变;与这些结果一致的是,在皮质酮处理小鼠皮层区域也观察到星形胶质细胞TXNIP蛋白过表达、NLRP3炎症小体的激活和IL-1β蛋白的剪切成熟。同时,应激水平皮质酮可引起原代大鼠星形胶质细胞活化,糖酵解终产物乳酸分泌减少,以及糖酵解关键酶基因PFKFB3表达降低,提示皮质酮可能影响原代星形胶质细胞糖酵解代谢的能力。在所开展中药成分干预研究中发现,淫羊藿苷与宝藿苷Ⅰ可通过下调TXNIP基因与蛋白表达水平,上调TRX-1蛋白水平,减轻细胞内氧化应激状态,抑制NLRP3炎症小体的激活,减少IL-1β成熟;白藜芦醇、紫檀茋和桑皮苷A可通过直接抑制模型细胞内活性氧的升高,抑制NLRP3炎症小体的激活,减少IL-1β成熟。本文研究结果为抑郁症慢性应激所引起中枢星形胶质细胞病理发生提供了新的机制,为发现改善星形胶质细胞免疫炎性潜在抗抑郁中药活性成分奠定实验基础。