解淀粉芽孢杆菌PEBA20与细菌群体行为相关基因研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:Erinhim
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本研究主要检测了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PEBA20的群体淬灭基因aiiA,并对其群体淬灭功能进行了分析;分析了生物膜形成相关的yqxM-sipW-tasA操纵子及sinR基因,并构建sinR突变株,验证了其对生物膜形成的功能。主要研究结果如下:1.从B. amyloliquefaciens PEBA20基因组中克隆得到了aiiA基因,测序表明,该aiiA基因含有753个碱基的开放阅读框,同Genbank中提交的其它芽孢杆菌种aiiA类似基因具有很高的同源性。该基因为首次从B. amyloliquefaciens中获得。2.构建了aiiA基因融合表达载体pEASY-E1/aiiA并转入到大肠杆菌(Escherichia coli BL21 DE3)中过量表达。SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白得到正确表达。其大小为28kDa。将aiiA基因表达产物进行功能分析发现,该AiiA融合蛋白对胡萝卜软腐病菌(Pectobacterium carotovorum subsp.)侵染胡萝卜具有很好的抑制作用。3.克隆了B. amyloliquefaciens PEBA20中yqxM-sipW-tasA操纵子,测序结果表明,yqxM操纵子共有2078个碱基,tasA基因包含有786个碱基的开放阅读框, yqxM基因包含有672个碱基的开放阅读框。tasA基因的存在范围比较广,且相似度在65%-98%之间。sipW基因和yqxM基因在BLAST结果中只在B. amyloliquefaciens、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)中有所发现。4.构建了pEASY-T1空载体并以pEASY-T1质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因(knar),将kna基因构建到pMD18-T中并转入到E. coli DH5α,最终,获得了含有pMD18-T-kna的重组菌并能够成功表达kna抗性基因。5.根据B. amyloliquefaciens FZB42基因组序列设计引物,以B. amyloliquefaciens PEBA20染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增sinR基因上游约650bp和基因下游600bp的两端DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂,将此两段序列按同一方向分别插入骨架质粒pMD18-T-kna中knar表达单元的5’端和3’端,构成重组质粒pMD18-T-kna-sinR作为基因打靶载体。6.将构建好的sinR基因打靶载体用HindⅢ单酶切线性化后,电转化至B. amyloliquefaciens PEBA20感受态中,50μg mL-1卡那霉素抗性平板筛选。利用PCR鉴定方法筛选PEBA20基因缺失株,检测16个抗性转化子确定基因突变株。其中,6号转化子检测到目的条带,结果表明,sinR基因打靶载体成功进行重组。生物膜表型检测表明,sinR基因突变株在固体和液体培养基中较野生株均形成了结构更复杂的生物膜。
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