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肝癌在我国已成为我国恶性肿瘤致死病因的第2位。肝癌早期症状不明显,病情进展快,50.5%的新发肝癌患者出现在中国。目前肝癌的治疗主要包括外科手术切除肿瘤、放疗、化疗、介入治疗、射频消融治疗等,但效果不尽人意,因此预防肝癌的发生及改善预后是目前肝癌研究的热点。随着放疗技术的进展,放疗能够杀死肝癌细胞的同时也会造成周围组织的损伤,我们仍需要在提高放疗敏感性方面做更深层次的研究。TAB182又称TNKS1BP1,是通过酵母杂交实验研究Tankyrase 1时被第一次发现,一种参与DNA损伤后修复的蛋白,能够与能够和DNA-Pkcs相互作用,还可以影响DNA-Pkcs磷酸化,进一步参与DNA损伤应激反应,本实验室前期研究TAB182可以增加幅射的敏感性,并且具有调节细胞周期等功能,但在肝癌细胞中还没有深入的研究。阿司匹林是一种历史悠久的解热镇痛药,现广泛应用于心血管疾病中,阿司匹林在预防胃癌、食管癌的发生已经被证实,阿司匹林在抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡等方面也有广泛研究,但阿司匹林对于TAB182沉默的肝癌细胞的影响目前还没有相关研究。我们通过阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞可进一步抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡,为放疗及药物治疗肝癌提供新的基因靶点,改善患者预后。目的:本实验以离体的肝癌细胞为研究对象,通过稳定转染筛选单克隆技术建立TAB182沉默的HepG2细胞模型,研究γ-射线和阿司匹林对TAB182沉默的HepG2细胞的影响。方法:通过CCK-8、细胞平板克隆形成实验,研究γ-射线照射后HepG2细胞增殖率和存活率的变化,并应用流式细胞学检测照射后HepG2细胞周期的变化。通过CCK-8实验验证阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞后增殖能力的变化,流式细胞学检测阿司匹林对TAB182沉默的HepG2细胞周期及凋亡的改变。应用Western blot检测照射及阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞后凋亡蛋白的表达。结果:1抑制TAB182基因表达可增加肝癌HepG2辐射敏感性1.1成功建立的TAB182沉默的HepG2细胞系:与稳定转染对照质粒的HepG2-NC细胞对比,TAB182蛋白在HepG2-sh-TAB182细胞中表达降低,说明TAB182沉默的细胞系建立成功。1.2沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用:分别于0、2、4、6、8Gy的γ-射线照射24h后收集HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞,采用CCK-8方法检测细胞的增殖能力,2Gyγ-射线照射下,HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞与未照射细胞相比,增殖率没有明显变化(P>0.05)。与未照射HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC细胞相比,在4、6、8Gyγ-射线照射后,HepG2-sh-TAB182细胞较未照HepG2-sh-TAB182细胞增殖率明显降低(P<0.05),而HepG2-NC细胞在8Gyγ-射线照射后才出现增殖率的降低(P<0.05);在同一剂量下,HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞相比增殖率下降(P<0.05),说明沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用。1.3沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞生存率的抑制作用:采用细胞克隆形成实验检测0、1、2、4、8Gyγ-射线照射下HepG2细胞生存率的变化。在1Gyγ-射线照射后,HepG2-sh-TAB182细胞与未照射HepG2-sh-TAB182细胞相比生存率明显降低(P<0.01),而HepG2-NC细胞与未照射的HepG2-NC细胞相比生存率没有明显变化(P>0.05),在2、4、8Gyγ-射线照射后,HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞与各自未照射细胞比较生存率均出现明显的降低(P<0.01)。在同一剂量下,HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞相比生存率降低(P<0.05),说明沉默TAB182基因表达能增加辐射对HepG2细胞生存率的抑制作用。1.4沉默TAB182能延长HepG2细胞幅射后G2/M期的周期阻滞:γ-射线照射后HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞均出现G2/M期阻滞,但在照射后24小时,HepG2-sh-TAB182细胞在G2/M期的周期阻滞依然存在,而HepG2-NC细胞的G2/M期的周期阻滞已经解除,说明沉默TAB182能延长HepG2细胞幅射后G2/M期的周期阻滞,抑制细胞分裂,此可能导致细胞凋亡增加。2抑制TAB182基因表达可提高阿司匹林对HepG2细胞的疗效2.1沉默TAB182基因能增加阿司匹林对HepG2细胞增殖抑制作用:分别应用0、0.5、1、2、4、8、16mmol/l阿司匹林作用24小时收集HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞,随着阿司匹林浓度的增加,对两种细胞增殖抑制率也逐渐增高,在相同浓度下,HepG2-sh-TAB182细胞比HepG2-NC细胞增殖抑制率要高(P<0.05),说明沉默TAB182基因能增加阿司匹林对HepG2细胞增殖抑制作用。2.2沉默TAB182能延长HepG2细胞幅射后G2/M期的周期阻滞:将8mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞,发现HepG2-sh-TAB182细胞在4h即有明显得G2/M期周期阻滞(P<0.01),而HepG2-NC细胞在4h时未发现G2/M期周期阻滞,在12h及24小时时两者均存在G2/M周期阻滞(敲低组P<0.01,对照组P<0.05),在36h,HepG2-sh-TAB182细胞仍存在周期阻滞,而HepG2-NC细胞周期阻滞已经解除,说明TAB182基因沉默后可延长阿司匹林作用后HepG2细胞G2/M期的周期阻滞,抑制细胞分裂。2.3沉默TAB182能增加阿司匹林对HepG2细胞凋亡:将0、1、8、16mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞,阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182细胞后即出现凋亡,随着阿司匹林浓度的增加,细胞的凋亡率也随着升高,而HepG2-NC细胞在8、16mmo/l的阿司匹林作用下才有凋亡的增高(P<0.05),相同浓度下的HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞相比较,HepG2-sh-TAB182细胞的凋亡率明显高于HepG2-NC细胞(P<0.05),说明沉默TAB182能增加阿司匹林对HepG2细胞凋亡。2.4沉默TAB182能增加辐射及阿司匹林作用后HepG2细胞凋亡蛋白的表达:将4Gyγ-射线照射、16mmo/L阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞后发现,cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白均较阿司匹林作用前表达明显增加(P<0.05),辐射后HepG2-sh-TAB182细胞比HepG2-NC细胞cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白的表达也明显增加(P<0.05),说明沉默TAB182可促进辐射后的细胞凋亡。结论:1验证成功建立的TAB182沉默的细胞系2沉默TAB182后,在照射及阿司匹林的处理下,能够抑制细胞的增殖率、生存率及细胞分裂,造成细胞凋亡。本实验发现TAB182可能是肝癌治疗的敏感基因,可能为肝癌的治疗提供新的治疗靶点。