研究背景骨组织是人体内较稳定的矿化结缔组织结构,其中含有4种活性细胞成分：成骨细胞(osteoblast)、破骨细胞(osteoclast)、骨衬细胞(bone lining cell)及骨细胞(osteocyte)。尽管在生理特性上其有惰性的一面,骨组织其实是一种具有高度活力的器官,其内部一直发生着成骨细胞的新骨形成及破骨细胞的骨吸收的骨重塑(bone remodeling)过程。简单来说,骨重塑就是新骨替代旧骨的过程。实际上骨重塑是一个高度复杂及协调的循环过程,主要包括3个连续却无法截然分开的阶段：(1)破骨细胞启动骨吸收；(2)由骨吸收到新骨形成的过渡期；(3)成骨细胞的新骨形成期。这个过程的发生有赖于破骨细胞、成骨细胞、骨细胞及骨衬细胞之间的协同作用,这4种细胞共同形成了临时的解剖结构——基本多细胞单位(basic multicellular unit, BMU)。有证据表明,骨细胞充当机械应力感受器(mechanosensor)并参与调控骨重塑的过程。正常的骨重塑是骨折修复、骨骼的机械适应性及钙稳态所不可缺少的过程。另一方面,如骨吸收及骨形成之间的平衡被破坏,将会导致多种骨骼疾病的发生,如过度骨吸收会导致骨量丢失或骨质疏松,相反,如骨形成过度则会发生骨硬化症。因此,骨吸收与骨形成间的平衡是至关重要的,且有赖于局部及全身多种因素如激素、细胞因子、化学因子及生物刺激等的协同效应。各种原因造成的骨折愈合障碍(延迟愈合、不愈合等)目前依然是骨折治疗术后最为常见且后果严重的并发症,往往需要多次住院及手术治疗,除治疗周期的延长外,其预后往往无法预料,对病人卫生保健系统来说是一种沉重的负担,而对骨科学者来说则是一项严峻的挑战。因此,如何预防及治疗这些并发症一直是众多骨科学者孜孜不倦所研究的重心。在骨不连的治疗领域存在着一种“钻石四边理念”(Diamond Concept),该理念强调在治疗骨不连时应同时予以生长因子、支架及成骨细胞,并在需要的时候更换骨折固定方式。我们认为在这理念中生长因子的范畴应该是广义的,不单指生长因子(growth factor),还应包括激素、药物等一切有生物效应的物质,而在这当中较有研究前景的还包括他汀类药物(statins)。他汀类是临床上治疗高胆固醇血症最主要的药物,然而,除降脂作用外,他汀类药物尚被发现可发挥一系列如促进骨再生、抗氧化、抗血栓形成及免疫抑制等生物学效应。在这些效应中,促进骨再生这方面最受研究者的关注,且在这方面研究得最多的一种他汀类药物是辛伐他汀(simvastatin)。有足够的证据表明,辛伐他汀通过促进成骨细胞增殖分化、抑制成骨细胞凋亡及抑制破骨细胞形成及激活等途径发挥促进骨再生效应。然而,辛伐他汀对骨组织内数目最多的细胞类型——骨细胞的作用却鲜有报道。骨细胞是骨骼中重要的感受器、整合器及传感器,一直以来被认为是一种较不活跃的细胞。然而,有研究结果表明,骨细胞会在骨构建、代谢性骨病等高骨转换率(bone turnover)状态下发生凋亡。这一发现使学者们对骨细胞重新燃起了研究热情。近十年来,我们不断拓宽了对骨细胞功能的理解水平,最主要的原因是骨细胞的一些特异性标记物的发现,如牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)、骨硬化蛋白(sclerostin)等,使得我们对骨细胞的生理功能有了更深刻的认识。骨硬化蛋白(sclerostin)主要由骨细胞分泌,是骨形成的重要负向调节因素,主要通过抑制成骨细胞的增殖分化而抑制骨形成。骨硬化蛋白的表达受多种因素的调节,包括机械应力、局部细胞因子和内分泌等因素。众多实验研究证实,下调骨硬化蛋白的表达可导致骨形成及骨量的增加。在临床上,骨硬化蛋白的单克隆抗体被用于治疗妇女绝经后骨质疏松症,可显著降低骨硬化蛋白水平及恢复骨矿密度。核因子KB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白,且是肿瘤坏死因子(TNF)超级家族的一员,是目前发现的唯一具有诱导破骨细胞分化、发育及发挥细胞效应的因子。有研究证明,肢体不负重会导致增加骨细胞凋亡,并且会提高RANKL蛋白的表达水平。此外,骨细胞是RANKL的主要来源,抑制骨细胞凋亡可下调RANKL的表达。由此看来,骨细胞更像是骨构建(modeling)与重塑(remodeling)过程的“司令细胞”,通过骨硬化蛋白和RANKL调节成骨细胞与破骨细胞的功能。然而,目前为止仍缺乏阐明骨细胞的凋亡与骨硬化蛋白及RANKL的表达之间关系的相关资料。实验目的1、通过动物实验的方法,并从医学影像学、组织病理学、分子生物学等多个角度,探讨辛伐他汀在大鼠胫骨开放截骨模型骨愈合过程中所起的作用,并重点观察辛伐他汀对骨细胞凋亡的作用情况,为后续的研究提供理论依据。2、通过SD大鼠原代骨细胞分离培养,验证辛伐他汀、骨细胞凋亡及骨硬化蛋白、RANKL的表达之间的关系,并初步探讨这之间可能的分子机制,从而为该药物在骨科临床上的应用提供更充分的理论依据。实验方法一、动物实验1、载辛伐他汀克氏针的制备160mg辛伐他汀原料药溶于由1.5m1乙酸乙酯及100mg PDLLA组成的溶液中,得出浓度为10% W/W的辛伐他汀工作液。将直径1.Omm、长30mm的克氏针在辛伐他汀工作液中蘸2次,在层流环境中自然干燥后-20°保存备用。2、建模及分组。72只雌性SD大鼠随机分为辛伐他汀治疗组及对照组。采用Christine等报道的方法建立SD大鼠胫骨开放截骨模型,治疗组用载药的克氏针作髓内固定物,对照组的固定物则仅含PDLLA涂层。3、影像学检查于术后2周、4周及8周,戊巴比妥钠麻醉大鼠后,拍摄大鼠右胫骨侧位X线片影,并按照改良Lane-Sandhu X射线评分标准对拍摄所得的X线片进行评分。4、组织病理学检查于术后2周、4周、8周用空气栓塞法处死动物,取出标本后依次进行脱钙、脱水、透明、透蜡、包埋等处理,最后将组织块切成5μM的薄片,并采用HE及番红O-固绿对组织切片进行染色,并于光镜下观察结果。5、Western blot检测于术后2周、4周及8周采用western blot技术检测2组实验动物骨痂中骨硬化蛋白及RANKL的蛋白表达水平。6、Real-time PCR检测采用Real-time PCR检测术后第2、4、8周2组实验动物骨痂中Bcl-2、caspase-3、sclerostin及RANKL mRNA的表达水平。RT-PCR按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行。7、免疫组织化学染色术后4周时,采用免疫组织化学染色法检测组织中caspase-3、sclerostin、 α-SMA蛋白的表达量。8、TUNEL原位细胞凋亡检测采用TUNEL原位细胞凋亡检测法检测术后第4周时2组实验动物标本中骨细胞的凋亡情况,实验操作按生产商提供的说明书进行。9、生物力学检测在术后第8周,采用三点弯曲试验对2组的胫骨标本进行生物力学分析,记录最大载荷并计算出标本的弹性模量。所得结果与同一实验动物健侧胫骨自我比较,结果以占对侧百分比的形式表示。二、细胞实验1、SD大鼠原代骨细胞的分离培养无菌条件下将3只SD乳鼠的长骨及颅骨取出,剔除干净骨膜及其他附着于骨骼上的软组织,取Hank’s平衡盐溶液将长骨内骨髓组织冲出,然后通过序贯、交替的胶原酶消化及EDTA脱钙法进行骨细胞的分离。用α-MEM培养基(含5%胎牛血清+5%小牛血清)培养原代骨细胞,至细胞长至融合状态时进行细胞传代。本研究使用第5-10代细胞进行实验。2、骨细胞的鉴定骨细胞的鉴定要点有：(1)细胞外形特点：细胞外形呈星形或树枝状,形态偏圆偏短,表面有4个以上的突触并与周围细胞形成联系；(2)细胞上清液中碱性磷酸酶测定值较低(与成骨细胞相比较)；(3)骨钙蛋白表达水平较高。3、骨细胞凋亡模型的建立采用肿瘤坏死因子-α刺激骨细胞而形成骨细胞凋亡模型。为了获得TNF-α的最佳刺激浓度,使用流式细胞术检测不同浓度(5、10、20、40ng/ml) TNF-α刺激下骨细胞的总凋亡率,TNF-α作用时间为24小时。4、骨细胞凋亡检测采用TUNEL细胞凋亡检测法检测在不同处理条件下骨细胞的凋亡情况,检测操作按产品说明书进行,荧光显微镜下观察,激发波长为460nm,发射波长为545nm。5、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)检测采用细胞活性氧簇检测试剂盒(Deep Red Fluorescence)检测骨细胞细胞内的活性氧簇,实验步骤按产品说明书进行,采用荧光酶标仪检测各孔的荧光信号强弱,荧光酶标仪激发波长为650 nm,发射波长为675 nm。未处理组细胞用于设定背景荧光强度。6、Real-time PCR采用Real-time PCR检测骨细胞中IL-1α、TNF-α、NF-κB mRNA的表达水平。RT-PCR按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0试剂盒说明书进行。7、Western blot检测采用western blot检测骨细胞中骨硬化蛋白、RANKL蛋白表达水平及MAPKs、NF-κB信号通路及相关凋亡因子(Bax,Bcl-2,caspase-3)在不同条件下的活化情况。实验结果一、动物实验1、影像学检查及Lane-Sandhu评分影像学检查提示术后2周2组实验动物的X线片表现并无明显差别,均未见明显骨痂形成。术后4周、8周辛伐他汀治疗组无论从骨痂形成量还是愈合质量均优于对照组。Lane-Sandhu影像学评分显示：术后2周,实验组动物的评分为(0.26±0.86)分,对照组为(0.35±1.00)分,统计结果为P>0.05,无统计学差异。术后4周,实验组动物的评分为(4.92±1.44)分,对照组为(3.58±2.06)分,统计结果为P<0.05,且辛伐他汀治疗组优于对照组。术后8周,实验组动物的Lane-Sandhu评分为(7.92±2.53)分,对照组为(5.17±1.94)分,统计结果为P<0.05,故2组动物在术后4周的Lane-Sandhu评分差异具有统计学意义,且治疗组优于对照组。2、组织病理学检查结果HE染色结果显示：术后第2周时,2组动物胫骨的骨折间隙由炎性纤维组织填充,均未见明显纤维性骨痂形成。骨折固定术后4周,2组实验动物骨折端均可见骨痂形成,实验组的骨痂形成量较多,且骨痂中可见大量新生血管,纤维骨痂逐渐被软骨性骨痂取缔。骨折内固定术后8周,辛伐他汀组软骨骨痂周边连续不断为新生骨小梁取代,骨小梁粗细较均匀,且骨小梁排列亦较术后4周时整齐,由此可见实验组硬骨痂已逐渐开始塑形过程。相比之下,对照组软骨骨痂数量相对较少,软骨化骨进程缓慢,新生小梁状骨排列紊乱无序。番红O-固绿染色结果显示2组实验动物组织的染色结果显示,2组中均可见软骨性骨痂,且辛伐他汀组骨折部位软骨组织较对照组少,说明其骨折区软骨化骨进程比对照组快。3、Western blotting检测结果Western blotting检测结果显示术后2周、4周及8周,辛伐他汀处理组实验动物骨痂中骨硬化蛋白及RANKL的蛋白表达量均显著比对照组低；而同一组实验动物在不同时间期间此两种蛋白的表达量亦存在显著性差异,并呈递减趋势。4、Real-time PCR结果Real-time PCR检测结果提示：术后2周,实验组caspase-3、sclerostin及RANKL mRNA的表达水平均低于对照组(p<0.05)；实验组Bcl-2 mRNA的表达水平较对照显著升高。术后4周,实验组caspase-3、sclerostin及RANKL mRNA的表达水平依然低于对照组(p<0.05),实验组Bcl-2mRNA的表达水平依然较对照显著升高。术后8周,2组实验动物caspase-3、sclerostin mRNA水平的比较无显著性差异,而2组实验动物Bcl-2 mRNA的表达水平比较,对照组依然低于实验组,差异有统计学意义(p<0.05),实验组RANKL mRNA表达水平较对照组高,差异有统计学意义(p=0.008)。对各指标行单因素方差分析后发现,除RANKL外,各指标的表达水平随时间推移而均有所下降。5、骨细胞凋亡检测结果TUNEL原位细胞凋亡检测结果显示在骨折术后第4周时,对照组大鼠组织切片中TUNEL阳性的骨陷窝数量显著多于实验组,经统计分析得出二者之间差异存在统计意义(t=3.648,p=0.004)。6、免疫组织化学染色结果免疫组化染色结果显示,与实验组相比,对照组实验动物骨组织中caspase-3及sclerostin的蛋白表达量显著增多,两者差异有统计学意义。然而,在术后第4周时对照组大鼠骨痂中的微血管密度却比实验组少,且差异存在统计学意义(p<0.05)。7、生物力学测试结果骨折治疗后8周三点弯曲力学性能检测结果显示,对照组的最大载荷及弹性模量均小于实验组,差异有统计学意义(p<0.05)。二、细胞实验1、SD大鼠原代骨细胞的分离培养及鉴定骨细胞分离培养初期,可见有少许成骨细胞及成纤维细胞共同生长,经多次消化、传代后骨细胞逐渐纯化,形成长势良好、外形独特的细胞系。骨细胞外形多呈星形或树枝状,细胞表面有多个长突触,并与周围细胞形成联系,而成骨细胞多外形多为梭形、锥形或立方形,细胞表面突触少且细。骨细胞体型较成骨细胞小,但更立体。此外,骨细胞的碱性磷酸酶活性比成骨细胞低(p<0.01),而骨钙素表达水平却显著高于成骨细胞(p<0.01)。2、最佳TNF-α刺激浓度及辛伐他汀处理浓度流式细胞术结果示,骨细胞的总凋亡率随TNF-α刺激浓度升高而相应升高(F=71.57,P<0.000)。根据检测结果,本研究最终选用20ng/ml作为TNF-α的刺激浓度。MTT比色法检测结果示骨细胞的活性随着辛伐他汀刺激的浓度升高而下降(F=57.04,P<0.000),根据结果,选取10-5 mol/L作为本次实验辛伐他汀的主要处理浓度。3、ROS检测结果骨细胞内活性氧簇检测结果显示,TNF-a显著刺激ROS的形成(P<0.01 vs对照组),而辛伐他汀预处理则可显著抑制ROS的形成(P<0.01 vs TNF-α处理组)。4、辛伐他汀抑制TNF-α诱导的骨细胞凋亡TUNEL检测结果显示TNF-α (20ng/ml)刺激显著诱导骨细胞发生凋亡(P<0.01 vs对照组)。辛伐他汀预处理可显著抑制TNF-α诱导的骨细胞凋亡(P<0.01 vs TNF-α处理组)。此外,流式细胞术显示出相近的结果,且ROS清除剂NAC对骨细胞预处理后同样显著抑制骨细胞凋亡。5、TNF-α诱导骨细胞上调sclerostin、RANKL蛋白的表达Western blot结果显示,20ng/ml的TNF-α刺激骨细胞24 h后,骨细胞中sclerostin及RANKL蛋白的表达量显著高于对照组(P<0.01)。辛伐他汀保护骨细胞30 min后再使用TNF-α进行刺激,辛伐他汀有抑制TNF-α对骨细胞上调sclerostin及RANKL蛋白表达量的效应,且该抑制效应呈浓度依赖性。6、辛伐他汀抑制TNF-α诱导的凋亡相关因子的活化Western blot检测结果显示,骨细胞暴露于TNF-α刺激后,显著增加了Bax蛋白的表达及减少了Bcl-2蛋白的表达。然而,辛伐他汀预处理骨细胞后,显著抑制了TNF-α上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白的效应。辛伐他汀处理组的Bcl-2/Bax比率显著高于TNF-α处理组。此外,caspase 3蛋白的检测结果与上述结果一致,TNF-α刺激可显著增加cleaved caspase-3蛋白的表达水平(P<0.01,VScontrol),表明caspase-3与TNF-α诱导的骨细胞凋亡相关,而对骨细胞进行辛伐他汀预处理可显著下调cleaved caspase-3蛋白的表达水平。7、辛伐他汀通过抑制JNK/NF-κB通路而抑制TNF-α诱导的骨细胞凋亡Western blot检测结果显示,骨细胞暴露于TNF-α刺激后,显著增加了JNK、p38及ERK蛋白的磷酸化。然而,辛伐他汀(10-5M)预处理抑制了JNK蛋白分子的磷酸化,而对p38、 ERK蛋白的磷酸化则无抑制作用。此外,TNF-α刺激尚可使IKKα/β的磷酸化水平上升(p<0.01),而辛伐他汀预处理则可减弱这种上调效应。另一方面,TNF-α刺激骨细胞可显著上调NF-κB的表达水平(F=42.27,P<0.0001),且呈时间依赖性。使用辛伐他汀及MAPKs信号通路抑制剂预处理骨细胞后western blot检测NF-κB蛋白的表达水平,结果显示,辛伐他汀及JNK抑制剂SP600125对NF-κB的表达有抑制作用,而p38及ERK抑制剂却无此作用。Western bolt检测JNK抑制剂SP600125及NF-κB抑制剂BAY11-7082对TNF-α诱导的骨细胞凋亡的作用,检测结果显示,辛伐他汀及JNK、NF-κB抑制剂显著抑制骨细胞中caspase-3蛋白的激活。8、辛伐他汀通过抑制JNK/NF-κB信号通路而下调sclerostin及RANKL蛋白的表达Western blot检测结果显示,JNK抑制剂SP600125及NF-κB抑制剂BAY11-7082显著抑制sclerostin及RANKL蛋白的表达。9、Real-time PCR结果本研究采用实时荧光定量PCR检测骨细胞凋亡对IL-1α、TNF-αmRNA表达的影响。PCR检测结果显示,TNF-α刺激显著增高IL-1α、TNF-αmRNA的表达水平,而辛伐他汀可显著抑制这些促炎性因子的表达,NF-κB抑制剂BAY11-7082应用亦可抑制IL-1α、TNF-αmRNA的表达。此外,TNF-a刺激显著增高NF-κB mRNA的表达水平,而辛伐他汀可显著抑制NF-κB mRNA的表达,此外,MAPK/JNK抑制剂SP600125的应用同样显著抑制NF-κB mRNA的表达。实验结论本研究通过结合体内、体外实验两部分,并从影像学、生物力学、组织病理学及分子生物学等多个角度,探讨辛伐他汀在骨再生方面的生物学效应及分子机制,着重观察其对骨细胞的影响作用,全文结果总结如下：1、局部应用辛伐他汀可加速开放截骨模型骨折修复的进程及提高骨折愈合质量,且这种促进效应与其抑制骨细胞凋亡、下调骨硬化蛋白、RANKL的表达有关；2、通过TNF-a的刺激,成功构建了骨细胞的凋亡模型,为后续骨细胞的功能研究提供了良好的细胞模型；3、辛伐他汀通过抑制ROS/JNK/NF-κB信号通路而进一步抑制凋亡相关因子的激活,最终抑制骨细胞凋亡；4、辛伐他汀抑制骨细胞表达骨硬化蛋白及RANKL,且该抑制效应同样与ROS/JNK/NF-κB信号通路有关。