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多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是存在于水环境中的具致癌、致畸和致突变性的持久性有机污染物,进入机体后可通过Ⅰ、Ⅱ相代谢酶进行代谢。为研究中华绒螯蟹暴露于多环芳烃时其机体内Ⅰ相代谢酶CYP家族基因和Ⅱ相代谢酶GST基因及它们相关酶的响应情况,本论文选取菲、(?)和苯并芘代表三环、四环和五环多环芳烃进行相关研究。一.基因克隆及其组织分布研究本研究获得中华绒螯蟹的CYP2A基因片段(861bp),及CYP2B和CYP4两基因完整开放阅读框(1476bp和1557bp)。相关生物信息学及进化树结果证实本研究所获基因属于CYP家族。本研究四种基因未攻毒时于中华绒螯蟹体内普遍存在,其中,肝胰腺、鳃、血淋巴和肌肉表达相对较高。二.毒物暴露对基因表达量及其相关酶活性的影响选择基因表达量高的肝胰腺、鳃、血淋巴和肌肉作为检测组织,在多环芳烃暴露条件下,研究四种基因的表达量及其相关酶活性随暴露浓度和暴露时间变化的情况。(一)菲暴露对基因表达量及其相关酶活性的影响暴露浓度实验:设置6个菲浓度(0、100、200、400、600和800μg/L),于24h检测肝胰腺中目的基因表达及相关酶活性。结果发现,CYP2A和CYP4基因的呈现先升高后降低趋势,CYP2B基因呈现先降低后升高再降低趋势,而GST基因则处于持续上升状态,CYP2A、CYP2B、CYP4、GST基因分别于菲浓度400、600、200和800μg/L时达到最高值。而CYP4和GST基因对菲浓度增加更敏感,分别于菲浓度200和800μg/L时有显著差异(P<0.05)。酶活性检测的结果发现,APND、ERND和GST活性随菲浓度升高呈现升高后降低的趋势,前两者于600ng/μL时达到高值;而GST酶则于400μg/L时达到高值。总之,本研究设定的菲浓度条件下APND、ERND、GST三种酶的活性均显著高于对照组(P<0.05),说明中华绒螯蟹肝胰腺中这三种酶对菲十分敏感。暴露时间实验:根据预实验结果,于安全浓度范围内设置200 μg/L的菲浓度开展暴露实验,持续28d,并于0、6h、12h、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d检测四种组织中目的基因表达及肝胰腺中相关酶的活性。结果发现,四种基因的表达量在四种组织中随时间变化呈现不同规律。CYP基因可能始终发挥作用,GST基因在暴露后期被诱导;肝胰腺中三种酶活性对菲敏感,除ERND酶于6h时外,三种酶在28d中持续处于高活性状态,与对照相比呈显著差异(P<0.05)。(二)(?)暴露对基因表达量及其相关酶活性的影响暴露浓度实验:设计10和100μg/L两个(?)浓度组及对照组,暴露持续28d,并于0、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d取中华绒螯蟹肝胰腺检测四种基因表达量和相关酶活性。结果发现,高浓度(?)对四种基因的诱导较显著,CYP2A和CYP4基因自1d起在高浓度中表达量显著高于对照组(P<0.05),GST基因也在1-21d时及CYP2B基因于1-14d时都显著高于对照组(P<0.05);此外,CYP2A、CYP2B、GST三种基因在2d时也被低浓度(?)诱导高表达(P<0.05),CYP2B基因较另两种基因对低浓度(?)更敏感,于1d时已呈现高诱导表达(P<0.05);三种酶活性无论浓度高或低自1d起均被显著诱导,且在1和2d时低浓度组对三种酶活的诱导显著高于高浓度组(P<0.05),APND酶在4d、7d、21d和28d时,ERND酶于4d、7d、14d和21d时,以及GST酶于14d、21d和28d时它们的活性与(?)浓度间具明显的浓度效应(P<0.05)。暴露时间实验:对高、低两个(?)浓度暴露时间效应分析,结果发现,两个暴露浓度与中华绒螯蟹肝胰腺中四种基因的表达量间呈现明显的时间效应,尤其于2d时四种基因在不同(?)浓度下诱导效应均较为明显(P<0.05);CYP2B对高、低浓度(?)的响应速度明显快于其他三个基因(P<0.05),此外CYP4对低浓度(?)的响应速度也明显较快,甚至快于对高浓度(?)(P<0.05)。高、低两个(?)浓度均对中华绒螯蟹肝胰腺中三种酶具诱导效应和明显的时间效应(P<0.05)。(三)苯并芘暴露对基因表达量及其相关酶活性的影响暴露浓度实验:设计两个苯并芘浓度组(0.15和0.45μg/L)和对照组(0μg/L),分别于0、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d取中华绒螯蟹的肝胰腺检测目的基因表达及相关酶活性。结果发现:高浓度苯并芘对四种基因的诱导作用明显;而三种酶的活性无论苯并芘浓度高或低自2d起均被显著诱导,且在1和2d时低浓度组对三种酶的诱导显著高于高浓度组(P<0.05),21d和28d时的APND酶,4d和28d时的ERND酶,及4-28d的GST酶的活性与苯并芘浓度间呈现明显的剂量效应(P<0.05)。暴露时间实验:将处理组与0d作对照,结果发现:CYP2A、CYP4和GST三种基因受高浓度苯并芘的诱导表达明显,且CYP4基因较另外两个基因的响应更迅速,高浓度组自1d起即显著高于0d(P<0.05);CYP2B基因对低浓度苯并芘的响应较其他基因敏感。不同时间点高、低浓度苯并芘对中华绒螯蟹肝胰腺中的三种酶均呈现诱导效应,且具明显的时间效应(P<0.05),其中三种酶对低浓度苯并芘的响应速度明显比对高浓度苯并芘的快,于1d时就表现出显著的活性差异(P<0.05),而高浓度苯并芘仅APND酶于1d时呈现显著的活性差异(P<0.05)。三.毒物暴露对对肝组织显微结构的影响分别取暴露在菲浓度2000μg/L、(?)浓度10和10μg/L、苯并芘浓度0.15和0.45μg/L,及它们的对照,于0和28d取肝胰腺做石蜡切片,结果表明,菲、(?)、苯并芘暴露均对中华绒螯蟹的肝组织造成较为明显的损伤。综合以上研究,三种多环芳烃均可诱导目的基因的表达,并呈现出一定的时间效应和浓度效应,且对相关酶也具有显著时间效应和浓度效应,此外在组织层面也会对肝胰腺造成损伤。