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4-壬基酚（4-NP）作为一种典型的环境内分泌干扰物（EDCs）,广泛存在于环境介质中,经食物链生物富集、生物放大作用,最终进入人体,可对机体内分泌、生殖系统产生影响。经口暴露是人群4-NP的主要暴露途径,具有低剂量、持久性的特点。现有研究主要集中于单次染毒或高剂量染毒,染毒剂量最低为10 mg/kg,时间最长为14天,未能贴合4-NP暴露的实际情况,且生殖毒性研究多关注雄性大鼠,4-NP致雌性生殖毒性的研究鲜有报道。研究4-NP低剂量长期经口暴露的代谢动力学行为,并以此为基础探讨雌性生殖毒性具有科学价值和现实意义。本文通过检测雌性大鼠在4-NP低剂量长期经口暴露下,血清中4-NP经时变化,通过MS EXCEL加载PKSolver工具计算4-NP代谢动力学参数,探讨4-NP在体内的代谢动力学行为。同时基于课题组前期研究,从4-NP低剂量长期经口暴露对性激素分泌影响,以及子宫组织能量代谢相关蛋白表达水平两个角度,探讨4-NP低剂量长期经口暴露对雌性大鼠的生殖毒性作用。研究内容具体包括以下两个部分:一、大鼠4-壬基酚低剂量长期经口暴露的代谢动力学研究80只雌性Sprague Dawley（SD）大鼠根据体重随机分为对照组、低-、中-、高剂量组,根据丹麦环保局设定的4-NP每日可耐受摄入量（TDI:5μg/kg）,确定中剂量组大鼠每日暴露剂量为500μg/kg（TDI×100（种属系数10×不确定系数10））,低剂量组为50μg/kg,高剂量组为10 mg/kg,对照组接受赋形剂羧甲基纤维素钠（CMC-Na）处理,所有大鼠连续灌胃17周。在染毒前（0天）,染毒之后的第1、2、4、6、8、10、13、17周周末,每组选取计划在17周处死的大鼠5只,经尾静脉采集大鼠血液。在染毒暴露后的第2、4、13、17周分别从每组中选取相应时间点计划处死的5只大鼠,麻醉处死,留取子宫、卵巢等组织。所有体液及组织样本均于-80°C保存。大鼠血清以β-葡萄糖酸酐酶、硫酸酯酶缓冲液温孵后,经C18小柱固相萃取采用超高效液相质谱联用技术（UPLC-MS/MS）检测目标物4-NP,通过MS EXCEL加载PKSolver工具计算大鼠低剂量长期经口暴露4-NP的代谢动力学参数,并将实验数据进行曲线拟合,结果表明,血清中4-NP经时变化符合血管外二房室模型且拟合效果良好。低-、中-、高剂量组大鼠血清中4-NP达峰时间(Tmax)分别为0.93-,1.14-,1.26周,峰值浓度(Cmax)分别为2.58-,2.73-,2.74 ng/mL。4-NP在低-、中-、高剂量组大鼠血清中的平均驻留时间（MRT）分别为5.28-,6.98-,7.03周,10周之后,各剂量组大鼠血清中4-NP浓度均下降至0.5 ng/mL水平以下。随着剂量的增大,4-NP从中央室消除的速率(k10)及自中央室向外周室转运的速率(k12)越来越小,低-、中-、高剂量组k10分别为0.62-,0.48-,0.32周-1,k12分别为0.38-,0.31-,0.18周-1;同时,分布相半衰期(t1/2α)则逐渐增大,分别为0.64-,0.81-,1.20周,中央室相关参数呈现剂量相关性。然而,外周室向中央室转运的速率(k21)分别为0.21-、0.17-、0.18周-1,清除相半衰期(t1/2β)分别为5.74-,7.55-,6.93周,可发现在低-、中剂量组,k21随4-NP暴露剂量降低,而t1/2β随剂量变化升高,但高剂量组k21与k12相等,t1/2β相比中剂量组下降,提示此剂量下4-NP在中央室和外周室之间的转运达到动态平衡,外周室清除速率增大。曲线下面积（AUC）及Cmax变化并不随着剂量的升高呈线性关系,随剂量增加,AUC增加有限,4-NP的生物利用度趋于饱和,吸收受到限制,呈现非线性吸收的特点。中央室、外周室总体清除率（CL,CL2）、表观分布容积（V,V2）均随着剂量的升高而成比例增大,提示剂量越大,4-NP从机体清除越多,在大鼠体内分布更为广泛。研究发现,4-NP低剂量长期经口暴露将显著影响大鼠血清代谢行为。4-NP长期经口暴露将导致雌性大鼠血清中4-NP达峰时间明显延后,在血清中驻留时间、清除半衰期均延长,进而导致到达稳态时间延后,提示在低剂量长期暴露下,4-NP在体内残留对大鼠机体可能带来的影响更为持久。二、大鼠4-壬基酚低剂量长期经口暴露致雌性生殖毒性初探性激素可反映雌性生殖系统内分泌状态。通过检测大鼠血清中促性腺激素释放激素（GnRH）、促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）及雌二醇（E2）水平发现,暴露前5周,随着暴露时间的延长,在低-、中-、高剂量组,大鼠血清中GnRH水平均增高,5周之后,中-、高剂量组大鼠血清GnRH水平出现下降,但低剂量组大鼠血清GnRH水平持续增高,提示4-NP对GnRH的分泌表现出“低剂量刺激、高剂量抑制”的现象,暴露时间越长,此现象越明显,与植物激素作用现象类似。LH由垂体分泌,受下丘脑分泌GnRH调控影响,在低剂量组,大鼠血清LH水平持续增高,而在中-、高剂量组,大鼠血清LH水平先上升后下降,与GnRH变化情况相一致,在17周实验期内亦表现出“低剂量刺激、高剂量抑制”的现象。低剂量组大鼠血清FSH水平暴露全程相比对照组无明显变化,中-、高剂量组大鼠血清FSH水平在暴露后10周均降低,且时间越长,降低越明显。E2由大鼠卵巢组织分泌,可促使平滑肌收缩以调节器官发育,在本实验中,各剂量组大鼠血清E2水平与对照组相比均持续下降,剂量越大,降低越明显。结合各剂量组E2、FSH、LH随时间变化情况,可推断在暴露全程17周中,4-NP低剂量长期暴露在大鼠体内主要的靶器官为卵巢,随暴露剂量升高逐步影响上游性腺下丘脑及垂体,以此扰乱下丘脑-垂体-卵巢调节轴的内分泌平衡,引起性激素分泌紊乱。课题组前期研究结果显示,4-NP低剂量长期（500μg/kg,8周）经口暴露可扰动雌性大鼠生殖系统能量平衡,从而对生殖系统产生影响。本文利用Western Blot技术,从糖代谢和脂肪酸β-氧化两个角度,通过检测大鼠子宫组织中能量代谢相关蛋白表达水平发现,PI3K、p-AKT1、PKM2、c-Myc蛋白表达上调,AMPK、CPT1、PPARg蛋白表达下调,高剂量组最为明显,以此推断,4-NP低剂量长期暴露可激活PI3K/AKT信号通路,通过诱导PKM基因的可变剪接向PKM2偏移引发有氧糖酵解,机体需摄取更多的葡萄糖满足自身代谢所需ATP,糖利用率因此下降;此外,CPT1蛋白表达降低提示脂肪酸β-氧化过程受到抑制,线粒体内三羧酸循环受阻,PPARg蛋白表达水平的降低进一步验证了脂肪酸转运蛋白减少,β-氧化受到影响,进而扰乱雌性生殖系统能量代谢。研究发现,大鼠4-NP低剂量长期经口暴露可致雌性生殖系统内分泌及能量代谢紊乱。性激素检测结果表明,4-NP低剂量长期暴露主要靶器官为卵巢,随剂量升高发展至下丘脑和垂体,以此扰乱下丘脑-垂体-卵巢性激素调节轴平衡,进而影响卵巢功能。此外,蛋白检测结果表明,子宫组织糖代谢从氧化磷酸化向有氧糖酵解方向偏移,糖利用率下降;同时脂肪酸β-氧化进程受到抑制,线粒体内三羧酸循环受阻,由此影响子宫组织能量代谢过程,产生潜在的雌性生殖毒性。