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壳聚糖是目前在自然界中发现的唯一带正电荷的天然高分子化合物,是一种碱性多糖,为甲壳素脱乙酰的产物,难溶于水,其价格随脱乙酰度的增加而提高。壳聚糖的降解产物为壳寡糖,它有很多特殊的生理活性与功能,如抑制微生物的生长、抗肿瘤活性、调血脂。目前报道的功能性壳寡糖是指不同脱乙酰度寡糖的混合体,而专门针对高脱乙酰度壳寡糖的活性功能研究报道较少。获得高脱乙酰度壳寡糖的传统方法是利用强碱和高温长时间作用甲壳素以获得壳聚糖,再用壳聚糖酶水解这种高脱乙酰度的壳聚糖而制得。该方法能源消耗大、环境污染严重,因此,本文旨在利用毕赤酵母系统表达一种来自Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶(CSN-P)和来自Colletotrichum lindemuthianum的甲壳素脱乙酰酶(CLCD),从而将低脱乙酰壳聚糖转化为寡糖,并进一步脱去乙酰基团制备高脱乙酰度的壳寡糖,以建立一套节能、环保、高效、均相制备高脱乙酰度壳寡糖的方法,为其功能活性研究提供基础。本文利用overlapping PCR方法,按照毕赤酵母密码子偏爱性合成了Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶基因并在毕赤酵母中实现了分泌表达。研究表明该壳聚糖酶在发酵罐中的蛋白表达量为3mg/ml,酶活力单位为25000U/ml。酶学性质研究表明CSN-P的最适pH为6.5,最适温度为55℃-65℃；在0.1%的SDS或10mM的Fe3+存在的条件下,CSN-P的活性完全被抑制,但在10M的尿素中仍有70%的酶活；该酶具有极高的耐热性,在80℃,90℃及100℃,半衰期分别为120min,60min和30min；在80℃保温60min,90℃保温30min和100℃保温15min后酶的残余活性仍有90%,比报道的Aspergillus fumigatus内源壳聚糖酶的热稳定性高。糖苷试剂盒染色、定点诱变和质谱分析表明CSN-P被O-糖基化,这可能是该酶在毕赤酵母中表达热稳定性提高的原因。50%脱乙酰度的壳聚糖水解实验表明该酶能很好地降解低脱乙酰度的壳聚糖为寡糖,24h后的水解产物主要为3-6糖,而且每个聚合度的寡糖含有不同个数的乙酰基团。以获得的低脱乙酰度壳寡糖为底物利用CLCD处理,结果显示CLCD能够很好地脱去壳寡糖上的乙酰基团。以上实验结果表明利用CSN-P和CLCD能够制备高脱乙酰度的壳寡糖。