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[背景]结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌微环境中存在大量肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)且其对结肠癌生长、浸润、转移具有重要的影响。目前TAMs与结直肠癌的关系尚不明确。一些临床研究报道结直肠癌中的TAMs浸润越多,肿瘤血管生成明显增加、肿瘤细胞分化更差,淋巴结转移率增高,与肿瘤预后呈负相关。也有研究发现TAMs与肿瘤的转移、肿瘤的分期和预后呈正相关。因此,TAMs与结直肠癌的关系,尤其是与肿瘤肝转移的关系有待进一步研究。α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达于多种非神经元细胞包括巨噬细胞。α7nAChR的表达失衡与肿瘤形成、进展等有关。目前TAMsα7nAChR表达情况以及α7nAChR受体活化后与结直肠癌的生物学行为的关系尚未见报道。[研究目的]研究肿瘤相关巨噬细胞的α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)对结直肠癌侵袭和迁移的影响,并初步探讨其作用机制。[研究方法]1.利用免疫组织化学方法检测51例结直肠癌患者组织标本中α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达情况,并在同一组织连续石蜡切片中,采用CD68标记结肠癌组织中肿瘤相关巨噬细胞,研究CD68阳性表达中的α7烟碱样乙酰胆碱受体表达与结直肠癌病人发生肝转移及预后的关系。2.利用THP-1细胞作为巨噬细胞模型,利用PMA使之诱导成为巨噬细胞,通过与肠癌细胞间接共培养使之成为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。采用siRNA技术下调α7nAChR在巨噬细胞中的表达,并对其进行验证。3.将TAMs与结肠癌细胞LoVo、SW620细胞间接共培养,利用Transwell小室检测TAMs下调α7nAChR后,LoVo和SW620细胞侵袭迁移情况。4.ELISA检测TMs与LoVo细胞间接共培养或者在LPS刺激情况下,巨噬细胞TNF-α的分泌情况。5.Western blotting检测TMs与LoVo细胞共培养后相关信号通路:PI3K、STAT3和NF-κB蛋白的表达情况。并利用相应信号通路的特异性抑制剂来明确α7nAChR的作用。[研究结果]1.CD68高表达于肿瘤间质组织,α7nAChR主要表达于细胞膜表面。在DukesA期病人的结肠癌组织中,CD68高表达而α7nAChR表达量相对较高;在Dukes D期病人的结肠癌组织中,CD68高表达而α7nAChR表达量相对较低。结合临床病理资料以及生存率分析:TAMs表面α7nAChR的表达与患者的性别无关(p=1.0),与年纪无明显相关性(p=0.455),而与肿瘤的转移有关:DukesD期的结直肠癌病人其TAMsα7nAChR表达明显降低,14个病人中13个表达小于等于1级,而只有1个病人其TAMs α7nAChR的表达大于等于2级;处于Dukes A/B/C期的病人37人中有20人的TAMs α7nAChR的表达小于等于1级,17个病人的TAMs α7nAChR的表达大于等于2级,差异具有统计学意义(p=0.010)。5年生存率在两组也有显著的差异(p=0.020)。2.慢病毒siRNA干扰技术构建两种单核细胞系THP-1、THP-lα7-/-,经体外诱导成为两种巨噬细胞TM和TMα7-/-,RT-qPCR和Western blotting验证TMα7-/-低表达α7nAChR。3.Trαnswell结果显示TAMs低表达α7nAChR,LoVo和SW620细胞侵袭和迁移明显增加。细胞迁移实验结果表明:LoVo细胞与TM或者TMα7-/-细胞共培养后,穿膜数量分别为(42±5.354)个和(85.5±9.665)个,p=0.007;SW620细胞穿膜数分别为(8.25±1.315)个和(84.25±10.81)个,p=0.0004。细胞侵袭实验结果显示:LoVo细胞与TM或者TMα7-/-细胞共培养后,穿膜数量分别为(85.5±3.797)个和(258.8±21.51)个,p=0.0002;SW620细胞穿膜数分别为(64.25±4.328)个和(122.5±6.171)个,p=0.0002。差异具有统计学意义。4.ELISA结果发现TAMs敲除α7nAChR在LPS刺激或者与LoVo细胞共培养后,细胞上清中TNF-α的分泌量明显下降。5.相关信号通路研究提示TAMs敲除α7nAChR后,与LoVo细胞共培养,NF-κBp65、STAT3、PI3Kp85的磷酸化水平明显下降。特异性信号通路抑制剂实验表明,TAMs抑制α7nAChR的表达后,AG490处理细胞可以明显抑制前者引起的肿瘤细胞迁移的增加,而Ly294002和Bay 11-7082处理TMs没有此现象。[结论]1.结直肠肿瘤组织浸润的巨噬细胞TAMs表面α7nAChR的表达与结直肠肿瘤转移及预后呈负相关。TAMs上α7nAChR低表达结直肠癌肝转移风险增加,TAMs上α7nAChR高表达结直肠癌肝转移风险降低。2.TAMs可以通过α7nAChR的表达抑制肠癌细胞的侵袭及转移。3.TAMs通过α7nAChR上调TNF-α的分泌,提示α7nAChR可调控TAMs转向于促炎作用。4.相关信号通路研究阐明TAMs/α7nAChR可活化NF-κB/STAT3/PI3K信号通路,而TAMsα7nAChR介导的肿瘤细胞侵袭转移下降主要与STAT3信号通路有关。