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随着抗肿瘤“弹头”药物的抗体导向治疗的研究进展,使得一些高效但毒副作用较大的药物充分发挥抗肿瘤作用的同时避免其毒副作用。高效“弹头”药物已成为治疗肿瘤的一种利器。我们实验的目的是对用精原细胞法筛选到的菌株C-3509发酵产物分离纯化,寻找高效抗肿瘤“弹头”药物,并对其抗肿瘤活性、机理进行研究。分类培养采用通常有代表性的培养基及国际链霉菌规划会议拟定的培养基（简称ISP培养基）,28℃静止培养21天,观察C-3509菌株的培养特征。颜色鉴定参考Ridgwa图谱;生理生化实验参照文献方法;细胞壁化学组份研究参照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法;磷酸类脂、醌类及G+C mo1%的分析按照中国科学院微生物所Ross、阮继生的方法进行。根据理化特征、生理特征及初步的16s DNA对菌株C-3509分类,其属于棘孢小单孢菌属（M echinospora）。与M.echinospora subsp.Calichensis cheamicins的产生株比较,C-3509在孢子形态、ISP系列培养基上的培养特征及对碳源利用的偏好与之不同。此外,在生长温度、细胞壁组成成份上两者也有所差别。我们在本实验室前期研究的基础上设计了含不同组份的培养基,比较其活性产物的含量。对活性产物含量高的培养基,用响应曲面法（response surfacemethodology RSM）对其培养基组份配比进行优化,首先用部分因子实验设计（Fractional Factorial Design FFD）筛选其中影响实验结果的重要因素（组份）,然后重点考察筛选出的重要因素,用梯度寻优法使得因素取值接近最优化水平。我们用响应曲面法对发酵培养基优化后,分别用原发酵培养基和改进的发酵培养基进行发酵,重复两次,用DNA断裂法检测活性产物的含量,改进后的培养基发酵液对DNA切割能力比初始培养基发酵液的DNA切割能力强约30倍。接着我们用大孔吸附树脂柱层析、乙酸乙酯萃取、正已烷沉淀、硅胶柱层析、薄层层析、高效液相制备柱层析等方法分离纯化活性产物。纯化的产物通过ESI-MS来确定其分子量,HR-ESI-MS来确定其分子式。我们根据上述的纯化方法得到粗品3,然后将粗品3用HPLC-MS分析,发现其中有四种组份组份A、组份B、组份C、组份D分子量分别为1321,1367,1344,1381,分别与已知的化合物calicheamicinγ1Br,calicheamicinγ1I。,calicheamicinβ1Br,calicheamicinβ1I分子量相同。我们对其中含量高的B组份进一步分离,得到纯度为87.8%的C-3509B,HR-ESI-MS确定其分子式C55H74N3O21S4I,辅以1H-NMR的分析,基本确定C-3509B是已知的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicinγ1I。我们用DNA断裂法、MTT法检测了C-3509B的生物学活性及细胞毒性。用流式细胞术检测了不同浓度C-3509B对人肝细胞周期阻滞情况。用Western blot检测低浓度的C-3509B引起HepG2细胞周期阻滞的分子学机制。DNA断裂法检测C-3509B的最小DNA损伤浓度为0.02μg/ml,MTT法检测C-3509B对多种细胞有极强的杀伤性。流式细胞术检测表明低浓度C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞周期阻滞,高浓度的C-3509B处理人肝癌细胞会引起细胞内的DNA断裂。Westernblot检测表明,在C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。我们以精原细胞法筛选到的小单孢菌菌株C-3509为出发菌,通过对其发酵条件的优化提高活性物质在发酵液中的含量,分离纯化出C-3509B。经过ESI-MS,HR-ESI-MS,UV和DNA断裂活性分析,推断C-3509B为Calicheamicinγ1I。我们对菌株C-3509分类研究表明,其是一株不同于M.echinospora subsp.Calichensis的棘孢小单孢菌。不同浓度的抗生素C-3509B对细胞有不同的损伤作用,低浓度的C-3509B会引起细胞G2/M期阻滞。C-3509B诱导Hep G2周期阻滞中可能与ATM/CHK2信号通路有关。