多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种能够引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、牛出血性败血症、牛肺炎等疫病的人畜共患性致病菌。根据菌体荚膜抗原的不同,可将其分为A、B、D、E和F5种荚膜血清型。以往在牛群中流行的主要是引起出血性败血症的荚膜血清B型,而近年来也分离到引起呼吸系统综合症为主的荚膜血清A型,该病已成为世界各地危害养牛业的主要疫病,给养牛业造成了巨大的经济损失。由于Pm的血清型比较多,异源或异型Pm交叉保护作用较低,给该病的防治带来了较大困难。目前,国内所用疫苗主要是针对牛出血性败血症的荚膜血清B型的传统灭活疫苗,尚无针对A型的疫苗。因此,开展牛源Pm A型保护性抗原的筛选鉴定,对新型疫苗（尤其是对不同血清型具有交叉保护作用的疫苗）的研发具有重要的理论意义和实际意义。本课题组先后从发病肉牛群中分离鉴定到6株A型Pm（PmCQ1^PmCQ6）和1株F型Pm（Pm F）,其中PmCQ1^PmCQ5为强毒株,PmCQ6为弱毒株。本研究利用第二代测序技术对PmCQ6和B型标准株Pm B菌株（CVCC450）进行全基因组测序,并结合之前实验室测序的PmCQ2和Pm F以及NCBI上公布的多个Pm全基因组序列,通过比较基因组学分析,揭示了不同菌株基因组结构及功能基因的差异,为新毒力基因的挖掘及致病机制的研究提供分子基础。然后通过生物信息学和免疫蛋白质组学分析,筛选出Pm保护性抗原候选编码基因,经克隆表达及间接ELISA或蛋白免疫印迹分析候选抗原分子的反应原性,最后,经动物攻毒保护性试验评价候选分子的免疫保护效力,并筛选到多个保护性抗原,该研究为新型疫苗的研发提供了候选分子。本课题主要研究内容如下:1.多杀性巴氏杆菌全基因组测序与组装本研究将实验室保存的不同血清型Pm菌株（Pm B、PmCQ2、PmCQ6和Pm F）经体外培养发现,4株Pm菌落大小存在明显的差异,尤其A型PmCQ6菌株明显小于Pm B、PmCQ2和Pm F菌株。通过小鼠和家兔致病性实验发现,4株菌株的致病性存在明显的差异,B型Pm B为强毒株,而A型PmCQ6为弱毒株。通过对雏鸡的致病性发现,4株Pm均不能引起雏鸡的死亡。本实验室前期已完成了牛源A型PmCQ2（强毒株）和牛源F型Pm F（弱毒株）的全基因组测序,为了更全面地分析牛源Pm的毒力基因差异和筛选交叉保护性抗原,我们使用第二代测序方法技术将获得的牛源A型PmCQ6（弱毒株）和牛源B型Pm B（强毒株）进行全基因组测序,利用SOAPdenovo完成拼接组装,并重新注释4株Pm基因组。通过4株Pm基因组比较得出,4株Pm基因组大小在2.2².3Mbp,预测ORF平均个数1977个,其GC含量约为39.1⁴0.39%,t RNA个数在43⁵0之间,均包含有16S-23S-5S r RNA元件。通过基因组信息图的绘制、基因组的功能注释和噬菌体相关基因的预测,我们得知4株Pm基因组均存在一定的差异。2.多杀性巴氏杆菌比较基因组学分析本研究将测序的4株菌株与NCBI数据库中已公布的24株Pm菌株根据core genes构建进化树,发现PmCQ2、PmCQ6和36950聚为一枝,Pm B与2213聚为一枝,Pm F与Pm70聚为一枝,我们选择不同宿主（牛、猪、羊、禽）和不同血清型（A、B、D和F型）的10株不同毒力的Pm进行比较基因组学分析。通过全基因组共线性分析得知,Pm基因组共线性较好,基因组比较保守,但不同菌株会出现不同片段的插入。对插入序列的预测发现,PmCQ2、36950和HN06菌株中都有大片段的插入序列,而Pm F株上未发现插入序列,推测强毒株与弱毒株毒力大小的差异可能存在于大片段转座子的插入与缺失。通过差异基因的分析预测,我们筛选到不同血清型和不同宿主源的差异基因,可以为种型诊断靶标的筛选和宿主嗜性分析提供理论依据。通过基因组岛、荚膜基因、脂多糖相关基因等毒力相关基因分析比较强弱毒株之间的差异,推测转座酶、噬菌体整合相关基因以及转录调节相关基因可能与强毒株与弱毒株或无毒株之间的毒力大小差异有关。通过与双组分调控元件数据库P2CS数据库比对,发现在Pm B和Pm F中有18个双组分调节元件,在PmCQ2和PmCQ6中有16个双组分调节元件,分属于7类双组分调节系统。最后,通过生物信息学分析筛选到4株共有的膜蛋白有458个,共有的分泌蛋白有162个,该结果为后续新型疫苗候选分子的筛选奠定基础。3.保护性抗原候选分子的筛选结合上一部分筛选的4株测序菌株共有的膜蛋白和分泌蛋白,经Signal和TMMHM在线网站对分析结果进行进一步预测,最后筛选到48个候选抗原基因。通过Triton X-114方法提取4株Pm的外膜蛋白,经免疫蛋白质组学分析,筛选到15个候选抗原基因。将以上两种方法筛选得到的候选抗原基因,经克隆表达,最终表达得到42个候选分子,纯化后使用实验室制备4种牛血清（PmCQ2人工感染血清、PmCQ2灭活苗免疫血清、Pm B人工感染血清和Pm F人工感染血清）经间接ELISA对其反应原性进行分析,共筛选到27个具有较高反应原性的候选分子。其中筛选到与4种血清反应原性较高的有5个;与A、B、F型人工感染血清反应原性较高有1个;与A、B型人工感染血清反应原性较高的有10个;仅与A型人工感染血清反应原性较高的6个;仅与B型人工感染制备的血清反应较高有5个。为了确定攻毒的最佳途径,我们首先将PmCQ2培养物分别通过滴鼻、腹腔和肌肉接种途径感染小鼠后,观察其存活情况、体内定植以及病理变化,结果显示三种途径下PmCQ2均能够定植于小鼠的肝、脾和肺等脏器中,且均能够引起肺脏发生病理变化,导致小鼠死亡,该结果提示小鼠建模成功。但由于Pm B通过滴鼻方式不能引起小鼠死亡,因此我们选择肌肉注射作为评价候选抗原分子保护性的最佳途径。选择反应原性较高的10个重组候选分子进行动物攻毒保护性试验,分析其免疫保护效果。结果表明,经r PmCQ2₁g0524和r PmCQ2₁g0311免疫后的小鼠均可以在一定程度上抵抗PmCQ2株的攻击,其保护性为30%,对Pm B和Pm F无保护性;同时发现对PmCQ2、Pm B具有交叉保护作用的为r PmCQ2₁g0376和r PmCQ2₁g0327,其保护性分别为50%/30%和50%/40%;对PmCQ2,Pm B和Pm F具有交叉保护性作用的有r PmCQ2₄g0132和r PmCQ2₂g0128,其保护性分别为80%/20%/10%和50%/40%/30%;仅对Pm B和Pm F具有一定的保护性的抗原为r PmCQ2₂g0128,其Pm B和Pm F保护性是40%和30%。该研究首次筛选到牛源A型菌株中具有交叉保护作用的候选分子。4.PmCQ2₁g0327交叉保护性研究基于生物信息学分析发现,PmCQ2₁g0327仅存在于A型Pm中,而PmCQ2₁g0376、PmCQ2₄g0132和PmCQ2₂g0128则在A、B、D和F型Pm中均存在。通过Pm全基因组序列的同源性分析和体外培养菌株的荧光定量PCR发现,该基因仅存在于A型菌株,在弱毒株PmCQ6菌株中表达较低,且不存在于Pm B和Pm F中。通过DNAstar软件和IEDB等线分析预测PmCQ2₁g0327存在的潜在的优势抗原表位序列,而且这些抗原表位多集中于该序列的N端。为了验证其潜在的优势抗原表位,将PmCQ2₁g0327全长基因分别截取7个片段进行克隆表达纯化,并通过间接ELISA分析反应原性,结果显示包含TIDTAPKQNPVPT抗原表位的216-306bp与PmCQ2、Pm B人工感染的血清反应原性较高。经动物保护性实验验证发现,该肽段对PmCQ2和Pm B的保护性分别是40%和10%,值得注意的是274-695bp的肽段对Pm B具有一定的保护性,推断该抗原表位能够在保护宿主抵抗Pm B的攻击中发挥主要作用。将r PmCQ2₁g0327蛋白序列和优势抗原表位序列与Pm B全基因组序列进行Blast分析,发现该序列与Pm B₁759g0022的同源性较高,将Pm B₁759g0022克隆表达,免疫小鼠后进行攻毒实验发现,r Pm B₁759g0022对Pm B的保护性为40%。由此推测该TIDTAPKQNPVPT抗原肽段在抵抗Pm B侵袭中起到关键作用。最后,纯化可溶蛋白r PmCQ2₁g0327制备小鼠多克隆抗体,其抗体效价为1:102400。通过WB结果可知,r Pm B₁759g0022与r PmCQ2₁g0327的鼠多抗有较好的反应原性。通过IFA实验结果表明,r PmCQ2₁g0327抗体能够特异地识别PmCQ2细胞壁和细胞膜上的抗原,并与之发生免疫反应,提示该蛋白主要分布于PmCQ2的表面。抗体封闭实验结果显示,r PmCQ2₁g0327在细菌黏附方面作用并不显著。综上所述,本研究我们结合生物信息学分析强弱毒株全基因,全面分析潜在的候选抗原分子,结合免疫蛋白质组学分析初次筛选到4个交叉保护性候选抗原分子。其中A型特异基因PmCQ2₁g0327具有较高的交叉保护性,其中TIDTAPKQNPVPT的肽段能够抵抗Pm B的侵染,在候选抗原的交叉保护作用中发挥关键作用。由此,PmCQ2₁g0327可作为Pm新型疫苗的候选抗原分子。