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布鲁氏菌病(Brucellosis)由布鲁氏菌引起的动物源性的人畜共患传染病。布鲁氏菌能进入机体并在机体内生存繁殖,逃避机体的免疫系统,机体固有免疫和适应性免疫通过抗感染免疫来监测、防御并清除入侵的病原体。病原体逃避宿主免疫大体上有三种途径,即隐匿、诱变和抑制。隐匿是指布鲁氏菌可能隐匿于自噬体中,干扰自噬体与溶酶体的融合,从而逃避宿主细胞的杀伤;诱变是指病原体通过改变自身的抗原特性,从而逃逸业已诱生的免疫应答的作用;抑制是指布鲁氏菌可抑制宿主细胞凋亡,避免在细胞死亡后被机体的体液免疫和细胞免疫清除,从而保护其在宿主细胞内的长期寄生,并造成持续性感染。IV型分泌系统(Type IV secretion systems,T4SS)是布鲁氏菌重要的毒力因子之一,它在布鲁氏菌感染的过程中可以将分泌蛋白转移到宿主细胞中,帮助其入侵和定殖,而这其中的机制还不完全清楚。本文主要研究T4SS分泌蛋白在布鲁氏菌感染过程中对细胞自噬和凋亡的影响。主要开展的研究工作如下:(1)构建流产布鲁氏菌2308(S2308)的VceA和VceC基因缺失突变株。分别扩增基因上下游同源臂和卡那基因,运用融合PCR融合三段基因并连接PMD18-T,同源重组的原理互换亲本株基因组中的目标基因,检测其生长特性,用两个缺失株分别侵染胚胎滋养层细胞(HPT-8)和感染小母鼠并检测其在胞内存活情况。结果显示成功构建缺失株ΔVceA和ΔVceC且稳定的传至少10代,生长趋势均在12 h达到对数生长期,30h进入平台期和亲本株无差异,在HPT-8细胞和小鼠脾脏中的存活能力显著低于亲本株S2308。(2)表达并纯化布鲁氏菌VceA和VceC蛋白,并分析其对细胞的影响。构建分泌蛋白VceA和VceC基因的原核表达载体,纯化后得到其重组蛋白。鉴定其反应原性,检测蛋白作用于细胞后细胞因子的表达量。结果显示成功构建VceA和VceC原核表达载体,纯化的蛋白Western blot检测出现杂交条带,具有很好的反应原性,VceA蛋白作用于细胞后TNF-α,IL-1β,TGF-β1的分泌量均显著升高,VceC作用的细胞IL-18,TNF-α和TGF-β1的分泌量显著降低。(3)初步探讨VceA和VceC基因对细胞自噬的影响。检测自噬相关基因ATG5,p62,LC3的m RNA表达量;Western blot,共聚焦显微镜和小鼠子宫免疫组化检测p62蛋白的表达量,透射电镜检测自噬小体。结果显示ΔVceA侵染细胞后p62基因的表达显著低于S2308组,ΔVceC感染小鼠1 d和7 d时均显著高于S2308组,VceC蛋白则无差异;ATG5的表达中ΔVceA在侵染细胞3h,24 h和感染小鼠1 d和56 d均显著高于S2308组,ΔVceC在侵染24 h和感染28d显著低于S2308,VceA蛋白则是3 h和12 h显著低于NC组,VceC蛋白无显著性差别;LC3-II/LC3-I的比值中ΔVceA在侵染细胞12 h,24 h和感染小鼠1 d,7 d时均显著高于S2308,而ΔVceC在侵染细胞后显著低于S2308组。WB实验显示ΔVceA组的p62蛋白在侵染细胞时无显著性变化,在小鼠子宫中显著低于S2308组,ΔVceC组比对照组高,VceA蛋白作用细胞后显著高于NC组;ΔVceA组ATG5蛋白的表达高于S2308组,ΔVceC侵染组显著低于对照组,而VceC蛋白作用组表达则高于正常组。激光共聚焦显示ΔVceA组低于S2308组,ΔVceC高于S2308组;小鼠子宫p62的免疫组化实验显示在1 d,7 d和14d时ΔVceA组可见的免疫染色少于S2308组,而ΔVceC则是多于S2308组;在电镜下ΔVceA侵染组中发现自噬小体。结果表明ΔVceA不同程度的促进细胞自噬的发生,VceA蛋白抑制细胞自噬;ΔVceC是不同程度的抑制细胞自噬的发生,VceC蛋白促进自噬。(4)初步探究VceA和VceC基因对细胞凋亡的影响。检测凋亡相关基因Caspase-3,Bcl-2,Bax的m RNA表达量;Western blot检测Caspase-3,Bcl-2和细胞内细胞色素C(Cyt-C)蛋白的表达量;流式细胞术检测HPT-8细胞的凋亡率;激光共聚焦显微镜和小鼠子宫免疫组化实验检测Cyt-C的释放情况。实验结果显示Caspase-3基因的m RNA的表达水平在侵染24 h时和小鼠感染后1 d时ΔVceA都显著低于S2308组;Bax/Bcl-2的结果显示侵染细胞3 h,24 h和感染小鼠7 d时ΔVceA均表现为小于1,ΔVceC在侵染24h和感染7 d,14d比值小于1,VceA蛋白作用组在12 h,24 h时表现为大于1,VceC蛋白只在24 h大于1;Caspase-3蛋白的表达和Cyt-C蛋白的表达及定位在24 h两缺失株都低于S2308组,而Bcl-2抗凋亡蛋白的表达中两缺失株均高于S2308组,两蛋白均低于对照组;细胞流式术检测中12 h只有ΔVceC低于S2308,24 h二缺失株均低于亲本株;小鼠子宫免疫组化显示两缺失株组出现的免疫染色少于对照组。结果表明ΔVceA和ΔVceC都是在不同程度上抑制细胞凋亡的发生,而VceA和VceC蛋白则是促进细胞凋亡的。