论文部分内容阅读
食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,根据病理类型可分为食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)。食管癌也是我国最常见的五种恶性肿瘤之一,其死亡率在所有恶性肿瘤中排第四位。DNA损伤修复的完成有赖于机体极其复杂的调控网络,并且DNA损伤修复检查点在细胞周期的运转过程中,发挥着维持基因组稳定性的重要作用。DNA损伤修复检查点发挥作用的组件包括感受器(Rad17,Rad9-Rad1-Hus1,ATM,ATR等)、传感器/调节器(BRCA1,CLASPIN,Chk1,Chk2等)和靶点(Cdc25蛋白家族,P53,P21等)。Rad17蛋白,作为DNA损伤修复检查点组件的感受器,在DNA损伤早期即发挥十分重要的作用,与RFC蛋白结合,形成一种具有DNA结合活性的检查点特异性复合体,随后Rad17-RFC2-5蛋白复合体将Rad9-Rad1-Hus1复合体装配至DNA损伤位点,启动DNA损伤修复过程。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,1ncRNAs),是一类长度大于200个核苷酸的单链RNA分子,其中绝大多数不具备编码蛋白质功能,仅有少数能够编码多肽。近年来研究表明lincRNAs参与细胞生长、分化和代谢等多种生物学过程的调控,并且其异常表达与肿瘤、糖尿病、自身免疫病及神经退行性疾病等多种疾病密切相关。本研究以Rad17蛋白为靶点,通过RNA免疫共沉淀技术获取Rad17蛋白特异性抗体富集到的RNAs,并进行高通量测序,接着利用实时荧光定量PCR验证测序数据。根据PCR验证结果,最终确定NELFA mRNA能够结合Rad17蛋白,同时利用RNA pull-down实验反向证明Rad17蛋白的确能够与NELFA mRNA结合。为了深入研究NELFA mRNA与Rad17蛋白结合在食管鳞癌发生发展过程中的作用及其深层分子生物学机制,我们首先在食管鳞癌细胞系和正常永生化食管上皮细胞中检测了NELFA与Rad17基因的表达情况。结果发现在食管鳞癌细胞系中Rad17 mRNA和蛋白表达水平均有所升高,而NELFA仅有mRNA表达水平升高。在Rad17和NELFA的上游调控机制研究中,我们发现转录因子USF2在食管鳞癌细胞系中存在基因组扩增,导致其自身高表达,从而使得下游NELFA与Rad17基因高表达。同时细胞实验证实,利用ASO敲降NELFA mRNA,能够抑制食管鳞癌细胞系的生长和克隆形成,抑制DNA损伤修复过程,并促进细胞凋亡。进一步的分子生物学机制研究发现,利用ASO敲降NELFA mRNA,能够抑制Rad17与RFC2-5复合体的结合,同时CHK1、CHK2和BRCA1蛋白的磷酸化水平降低。最后,我们利用RNA scope技术进行RNA原位杂交实验,检测食管鳞癌和癌旁组织石蜡切片中NELFA mRNA的表达。结果证实,与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中NELFA mRNA表达水平升高。进一步的统计分析发现NELFA mRNA的表达量与食管鳞癌患者生存和预后密切相关,可作为一项独立的预后指标。以上研究结果表明,NELFA mRNA的异常表达对食管鳞癌的发生发展具有十分重要的促进作用。