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目的:
建立检测GITRmRNA的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法,并通过检测AR病患者外周血中GITRmRNA的表达水平以探讨GITR分子在该疾病中的意义。
方法:
(1)制备含GITR基因的重组质粒,并以此重组质粒作为标准品,建立检测该基因的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并评价该方法的线性范围、特异性及精密度水平。
(2)运用上述方法检测采用实时荧光定量PCR方法检测变应性鼻炎患者组(n=23)、临床缓解组(n=17)及正常对照组(n=24)外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中GITRmRNA的相对表达水平,来评价GITR与AR的相关性。
结果:
(1)重组质粒经PCR、限制性内切酶酶切及测序鉴定为含GITR目的片段103个碱基对,未突变。该方法标准曲线的相关系数r2为0.999,线性范围为(101~106)copies/μ1,最低检出限达101copies/μ1,批内CV为6.8%,批间CV为12.9%和9.2%。
(2)AR未治疗组(n=23)外周血中GITRmRNA相对表达水平明显高于AR临床缓解组(n=17)和正常对照组(n=24)(x2=7.80,P<0.05;x2=1.2.43,P<0.01),而AR临床缓解组外周血中GITRmRNA相对表达水平与正常对照组相比较无统计学意义(x2=0.056,P>0.05)。
结论:
(1)本研究建立的检测GITRmRNA的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好。
(2)GITR可能参与了变应性鼻炎的病理过程,GITR参与变应性鼻炎病理过程具体机制有待进一步研究。