论文部分内容阅读
目的:卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,死亡率居所有妇科肿瘤之首,是严重威胁女性生命与健康的公共卫生问题。随着分子医学和肿瘤靶向治疗的发展,卵巢癌的临床疗效有了很大的提高。然而,卵巢癌患者的总体预后仍相对较差。肿瘤发生发展是一个复杂的生物学过程,伴随大量基因的异常表达,因此解析卵巢癌耐药、复发等恶性进展过程中的潜在分子机制,对于新疗法关键分子靶点的鉴定和筛选,具有重要的临床意义。TRIM29是三结构域蛋白（tripartite motif-containing proteins,TRIM）家族成员。与大多数TRIM家族蛋白的经典三结构域特征不同,TRIM29缺乏环指结构域（RING finger）,所以最初认为其缺乏E3泛素连接酶活性。TRIM29参与转录调控、发育、细胞增殖、细胞分化、自噬等多种生物学过程。近年来,TRIM29在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到重视。而在卵巢癌特定的组织遗传学背景下,解析TRIM29如何发挥作用,有待进一步阐明。SETBP1是一种主要在细胞核里表达的癌蛋白,可保护SET免受蛋白酶体降解,从而稳定全长的SET蛋白。SET也被称为蛋白磷酸酶2A的抑制剂（I2PP2A）,通过募集磷酸化PP2A（Y307）的激酶使PP2A失活。未磷酸化的PP2A通过靶向与增殖、细胞周期和细胞凋亡相关的多种激酶,充当经典的肿瘤抑制因子。在前期工作中,我们发现TRIM29在包括浆液性卵巢癌、黏液性卵巢癌、透明细胞癌等大多数类型的卵巢癌中显著上调。敲低TRIM29抑制了卵巢癌细胞的干细胞样特征,包括独立生存能力、侵袭性、球囊形成效率和对裸鼠的致瘤性。为此,本研究致力于:1、阐明TRIM29对SETBP1/SET/PP2A轴的调控作用以揭示TRIM29促进卵巢癌恶性进展的潜在机制;2、为鉴定卵巢癌有前景的治疗靶点提供一定的科学线索和理论依据。研究方法:1、使用CRISPR/Cas9系统构建TRIM29敲低的卵巢癌细胞系。2、定量蛋白质组学分析鉴定卵巢癌细胞中受TRIM29调控的潜在分子靶标。3、通过Western Blot检测CAOV3和A2780卵巢癌细胞中TRIM29敲低对SETBP1/SET/PP2A轴的影响。4、通过免疫组化和生物信息学分析评估TRIM29和SETBP1表达的相关性。5、使用PP2A的药物抑制剂LB100处理TRIM29敲低的卵巢癌细胞,分别通过克隆形成实验、Transwell侵袭实验和球囊形成实验评估肿瘤细胞的独立生存能力、侵袭性以及球囊形成效率。6、使用慢病毒感染的方法过表达SETBP1,以检测恢复SETBP1表达对TRIM29敲低的卵巢癌细胞独立生存能力、侵袭性、球囊形成效率以及裸鼠致瘤性的影响。7、通过实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测TRIM29敲低的卵巢癌细胞中SETBP1总m RNA和新生m RNA水平,以评估TRIM29对SETBP1转录的影响。8、构建包含SETBP1启动子序列的荧光素酶报告基因质粒,转染细胞48小时,检测TRIM29敲低对SETBP1启动子活性的影响。9、通过免疫荧光和核质分离检测TRIM29在卵巢癌细胞中的亚细胞定位。10、通过生物信息学分析评估卵巢癌细胞中SETBP1和VEZF1表达的相关性,并筛选VEZF1在SETBP1启动子区域潜在的结合位点。11、通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验分别检测VEZF1对SETBP1启动子活性的影响以及VEZF1与SETBP1启动子的互作。12、将靶向VEZF1的sh RNA转染TRIM29敲低的CAOV3和A2780卵巢癌细胞以沉默VEZF1基因的表达。13、分别通过克隆形成实验、Transwell侵袭实验检测VEZF1敲低对卵巢癌细胞独立生存能力、侵袭性的影响。14、通过RT-q PCR检测VEZF1 m RNA水平以评估卵巢癌细胞中TRIM29敲低对VEZF1转录的影响。15、分别使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）、蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂E64D+pepstain A处理对照或TRIM29敲低的卵巢癌细胞,以阐明TRIM29对VEZF1蛋白合成或降解的影响。16、构建包含VEZF1m RNA 5’UTR或3’UTR的荧光素酶报告基因质粒,转染细胞48小时,检测TRIM29对VEZF1 m RNA 5’UTR或3’UTR活性的影响。17、通过质谱分析筛选与VEZF1m RNA 3’UTR结合的潜在的RNA结合蛋白（RBPs）。18、通过RNA免疫共沉淀（RIP）和RNA pull down实验明确卵巢癌细胞中与VEZF1 m RNA 3’UTR结合的候选RBPs。19、通过生物信息学分析预测候选的RBPs在VEZF1 m RNA 3’UTR潜在的结合位点。20、构建包含不同VEZF1 m RNA 3’UTR部分缺失突变体的荧光素酶报告基因质粒,转染细胞48小时以明确候选RBPs与VEZF1 m RNA 3’UTR结合所必需的序列。结果:1、SETBP1被鉴定为卵巢癌细胞中TRIM29的关键分子靶标。2、TRIM29和SETBP1在卵巢癌组织中的表达呈显著正相关。3、TRIM29或SETBP1高表达提示卵巢癌患者的不良预后。4、TRIM29敲低对卵巢癌肿瘤干细胞样表型的抑制主要依赖于PP2A的活化。5、卵巢癌细胞中敲低TRIM29抑制SETBP1启动子活性。6、定位于胞浆的TRIM29间接调控SETBP1转录。7、转录因子VEZF1参与TRIM29对SETBP1启动子活性的调节。8、VEZF1敲低抑制卵巢癌细胞的独立生存能力和侵袭性。9、TRIM29敲低影响VEZF1蛋白的翻译速率。10、TRIM29以3’UTR依赖性方式促进VEZF1 m RNA翻译。11、RNA结合蛋白BICC1参与TRIM29对VEZF1m RNA翻译的调节。12、TRIM29敲低通过削弱BICC1向VEZF1 m RNA 3’UTR募集以抑制VEZF1的蛋白翻译。结论:TRIM29通过调控SETBP1/SET/PP2A轴驱动卵巢癌的恶性进展。从机制上讲,TRIM29通过招募RNA结合蛋白BICC1与VEZF1 m RNA 3’UTR互作促进其翻译,转录因子VEZF1通过促进SETBP1转录,使SETBP1/SET/PP2A轴持续活化,从而维持卵巢癌细胞的肿瘤干细胞样表型。综上所述,本项工作为TRIM29作为卵巢癌预后潜在的生物标志以及可能的治疗靶点提供了一定的科学线索和理论依据。