论文部分内容阅读
研究背景子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是妇科最常见的良性疾病之一,在育龄女性中发病率高达6%-10%,其中35-50%的患者伴有盆腔疼痛和不孕症,严重影响了女性的身心健康。EMs是一种雌激素依赖的慢性炎症性疾病,目前针对EMs的治疗主要是手术治疗和药物治疗,然而手术剔除异位病灶复发率高,抗激素治疗虽效果较好,但副作用大,不适用于有生育要求的女性。因此进一步深入研究EMs的发生机制,寻找新的关键作用分子,对临床治疗、分子靶向药物的研发具有重要意义。血管新生是EMs发生发展中的关键一环,大量的研究证实雌激素可通过上调促血管因子加速EMs的进程。近年来的研究发现Smad1蛋白在血管生成过程中发挥要作用。在小鼠体内特异性敲除Smad1基因,小鼠由于血管发育不良死于胚胎期,而激活Smad1信号通路不仅能促进内皮细胞的增殖、迁移和成管能力,也能促进生理及病理状态下的血管新生。研究目的探究E2通过激活Smad1蛋白促进血管新生进而促进EMs发展的分子机制。方法及结果收集临床异位子宫内膜标本及正常子宫内膜标本各10例,冰冻切片后,免疫荧光标记法检测血管内皮标记物CD31与p-Smad1在不同标本中的表达,结果显示异位子宫内膜组标本中血管内皮p-Smad1表达高于正常子宫内膜组。培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作为细胞模型。首先运用免疫印迹、免疫荧光检测E2对Smad1蛋白表达及其磷酸化水平的影响,结果显示E2能在30min内快速激活Smad1蛋白,并且促进其转入核内调控靶基因。用非细胞膜通透性雌二醇耦合牛血清白蛋白(E2-BSA)对HUVECs进行相同处理,得到了类似的结果。而蛋白翻译抑制剂放线菌酮(CHX)和转录抑制剂放线菌素D(Act D)并未对E2激活Smad1蛋白产生明显影响。继而分别用选择性雌激素受体alpha(ERα)、雌激素受体beta(ERβ)激动剂或阻滞剂,雌激素受体(ER)阻滞剂预处理细胞,通过免疫印迹观察其对E2激活Smad1蛋白的影响,结果提示E2激活Smad1蛋白的效应主要由ERα介导。随后运用免疫印迹、siRNA/过表达质粒转染的方法证实E2通过c-Src/ERK1/2级联反应激活Smad1蛋白。此外,在内皮细胞小窝(caveolae)抽提物中检测到ERα、c-Src,免疫共沉淀发现ERα、c-Src与小窝蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)发生交联。采用β-环糊精(MCD)破坏小窝结构或转染Cav-1 siRNA沉默Cav-1表达可阻断E2对c-Src/ERK1/2信号传导及Smad1蛋白的激活,表明在HUVECs细胞膜小窝内存在雌激素功能性信号传导模块。结论E2通过非基因效应激活Smad1蛋白进而促进HUVECs增殖、迁移、成管,且先后受小窝内的ERα/c-Src及ERK1/2调节。我们的研究为揭示E2促子宫内膜异位症进展的内皮分子作用机制提供新的思路。