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研究背景:卵巢癌(OC)在所有妇科癌症中的死亡率最高。患者的五年生存率低于30%。研究发现多种信号分子特别是激酶的表达或者活性的改变与癌症有关,其失调在疾病的发生和发展中起着至关重要的作用。其中蛋白激酶B(AKT)所参与的磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素的哺乳动物靶蛋白(mTOR)信号通路是人类癌症中最频繁改变的信号途径之一,并已成为在抗癌治疗中最有吸引力的靶标。做为一种激酶,AKT也会影响细胞中促进肿瘤发生的多个过程。其中AKT2是AKT三种亚型之一,作为编码酪氨酸激酶的基因,在多个卵巢癌细胞系中高表达,在40%原发性卵巢癌中高表达。AKT2参与细胞增殖、转移及存活的复杂信号转导途径,它的过度表达也与更低和更差的生存相关。M2型丙酮酸激酶(PKM2)在增殖细胞尤其是肿瘤细胞中高表达,其酶活性受到复杂的调节以使细胞适应不同的生理状态。除了作为丙酮酸激酶的作用外,PKM2还作为蛋白激酶和涉及细胞增殖、迁移和凋亡的基因的转录辅助活化因子发挥作用。在我们前期研究工作中,通过免疫共沉淀+质谱鉴定技术、以及用抗磷酸化AKT底物抗体进行的反向免疫共沉淀等实验发现PKM2是未曾报道过的AKT2的下游底物。鉴于AKT和PKM2各自在恶性肿瘤中的重要作用,我们尝试探索AKT2与PKM2及两者相互之间在卵巢癌细胞迁移和生长中的作用及机制。研究目的:本研究拟从细胞、动物模型和临床标本三个层面上探索AKT2通过PKM2在卵巢癌细胞迁移和生长中的作用及机制,从而初步阐明AKT2与PKM2在卵巢癌中作用的新机制,为卵巢癌诊断生物学标志物及靶向治疗靶点的确定提供实验线索。研究方法:1.收集临床卵巢癌标本,通过免疫组化检测AKT2、PKM2及相关蛋白的表达,分析各分子表达的相关性,同时分析各分子与肿瘤发展程度以及预后的联系;2.选取有代表性的卵巢癌细胞株SKOV3、HEY,通过慢病毒转导、siRNA转染及shRNA转染在细胞水平分别上调或下调AKT2及PKM2的表达。通过划痕实验、CCK-8实验及葡萄糖乳酸含量测定,研究AKT2及PKM2对卵巢癌细胞迁移和生长的影响,明确AKT2及PKM2在卵巢癌发生发展中所起作用,并探索两者之间关系及调控机制;3.通过Western-Blot探索卵巢癌细胞中AKT2或PKM2表达改变后,细胞中相关上下游相关蛋白的变化,进一步探索AKT2与PKM2在相关信号通路中的关系及可能涉及的分子机制;4.使用已构建好的各卵巢癌细胞株SKOV3进行裸鼠皮下注射,通过动物实验观察AKT2通过PKM2对裸鼠成瘤的影响,并进一步明确相关蛋白的表达和变化及可能的分子机制。研究结果:1.临床卵巢癌标本免疫组化结果经χ2检验后表明,AKT2、PKM2、STAT3、B淋巴细胞瘤-XL基因(BCL-XL)、TGFβ诱导因子同源框2(TGIF2)、(Jmj区域蛋白5)JMJD5在卵巢癌组织中的阳性率均高于正常组织,其表达差异均有统计学意义(P<0.001)。且经卡方检验及多因素Logistic回归分析判断,AKT2与PKM2、AKT2与JMJD5、PKM2与TGIF2、PKM2与STAT3在卵巢癌组织中的表达具有相关性;2.临床病理特征分析χ2检验结果显示:AKT2过表达及PKM2过表达与卵巢癌患者的存活与转移具有相关性(P<0.05)。AKT2与PKM2均与卵巢癌患者肿瘤大小具有相关性(P<0.05),TGIF2表达水平与卵巢癌肿瘤的TNM分期具有相关性(P<0.05);Cox模型多因素生存分析显示:卵巢癌患者的存活与转移(HR:2.796,95%CI:1.350-5.791,P=0.006)(P<0.01)、AKT2过表达(HR:1.624,95%CI:1.058-2.493,P=0.027)(P<0.05)及PKM2过表达(HR:1.853,95%CI:1.128-3.043,P=0.015)(P<0.05)具有相关性;3.Kaplan-Meier生存分析显示,PKM2过表达(阳性2+及以上)患者与表达低阳性及阴性(阳性1+及以下)患者生存函数差别具有统计学意义(Log Rank P=0.016,P<0.05);AKT2过表达(阳性2+及以上)患者与表达低阳性及阴性(阳性1+及以下)患者生存函数差别具有统计学意义(Log Rank P=0.032,P<0.05);表明PKM2及AKT2的过表达与患者的预后不良密切相关;4.免疫荧光及Western-Blot结果显示,成功构建过表达AKT2及过表达PKM2的稳定SKOV3及HEY细胞株。并成功构建下调PKM2表达的过表达AKT2的SKOV3及HEY细胞株、下调AKT2表达的过表达PKM2的SKOV3及HEY细胞株;5.Western-Blot结果显示,当卵巢癌细胞中的AKT2表达量上升时,PKM2的表达量亦随之上升,而当沉默卵巢癌细胞中的AKT2表达时,PKM2的表达量亦随之下降,表明AKT2对PKM2的表达起调控作用;而PKM2的表达量的改变并不会影响AKT2在卵巢癌细胞中的表达,表明PKM2为AKT2的下游分子。同时检测其他分子,发现STAT3及p-STAT3表达量与AKT2及PKM2表达量均呈正相关,表明STAT3可能为AKT2及PKM2的下游分子;而JMJD5、TGIF2分子表达量不受AKT2及PKM2的表达量改变的影响,表明其非AKT2及PKM2下游分子;6.划痕修复实验结果显示,卵巢癌细胞过表达AKT2或过表达PKM2均可提高其迁移能力,而相对的,沉默AKT2或PKM2表达及下调PKM2过表达细胞中的AKT2则会使细胞的迁移能力下降。结合之前Western-Blot结果等,表明AKT2可通过调控PKM2的表达改变细胞迁移能力;7.CCK-8实验结果显示,卵巢癌细胞过表达AKT2或过表达PKM2均可提高其增殖能力,而沉默AKT2或PKM2表达及下调PKM2过表达细胞中的AKT2则会使其增殖能力受到抑制。结合之前Western-Blot结果等,表明AKT2可通过调控PKM2的表达改变细胞增殖能力;8.培养基中葡萄糖乳酸含量测定实验结果显示,卵巢癌细胞过表达AKT2或过表达PKM2均可加大细胞对于葡萄糖的消耗,而沉默AKT2或PKM2表达及下调PKM2过表达细胞中的AKT2则会使卵巢癌细胞葡萄糖消耗降低;同样的,卵巢癌细胞过表达AKT2或过表达PKM2均可加大细胞乳酸的产量,而沉默AKT2或PKM2表达及下调PKM2过表达细胞中的AKT2则会使卵巢癌细胞乳酸产量降低。结合之前研究结果,表明AKT2可通过调控PKM2的表达改变细胞有氧糖酵解的能力,使细胞有氧糖酵解呈上升趋势;9.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,注射卵巢癌细胞中如过表达AKT2或过表达PKM2,均可使肿瘤生长变快,体积变大;而细胞中如沉默AKT2或PKM2表达及下调PKM2过表达细胞中的AKT2,则会使肿瘤生长变慢,体积变小。结合之前研究结果,表明AKT2可通过调控PKM2的表达调节肿瘤生长。结论:1.AKT2、PKM2、STAT3、BCL-XL、TGIF2、JMJD5在卵巢癌组织中的表达均高于正常组织,可以作为临床诊断靶点;AKT2与PKM2、PKM2与TGIF2、AKT2与JMJD5、PKM2与STAT3在卵巢癌组织中的表达具有相关性;2.AKT2及PKM2的表达与卵巢癌患者的存活与有无转移具有相关性;AKT2及PKM2的表达与卵巢癌病人肿瘤大小具有相关性;TGIF2分子表达与卵巢癌肿瘤的TNM分期具有相关性;3.PKM2及AKT2的过表达与卵巢癌患者较差的生存率及预后相关;4.AKT2及PKM2基因的过表达,可以提高卵巢癌细胞的迁移能力,并通过提高细胞有氧糖酵解的能力,提高细胞的生长能力。PKM2可能为AKT2的下游分子,且为STAT3的上游分子。PKM2受到AKT2的调控,同时又可磷酸化STAT3,通过调控STAT3的表达调节卵巢癌的发生发展。