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人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是存在于人血浆中的一种蛋白质,含量丰富,常作为载体蛋白,具有结合和运输的作用。HSA在人体内的半衰期长,可用于融合多肽药物蛋白从而延长药物的半衰期,但HSA融合多肽药物后分子量大,表达困难,也不易穿过血管壁,因此课题研究了新的抗HSA的单链抗体,单链抗体(Single-Chain Antibody Fragment,scFv)相比于完整的抗体分子,具有分子量小、组织穿透性好、结构中无糖基化修饰等特点,适用于大肠杆菌进行表达和纯化,相比于采用哺乳动物细胞表达,周期短,培养成本低。但大肠杆菌表达scFv也有存在着一些问题,如表达量低,难以可溶性表达等。本文通过HSA免疫小鼠进而制备杂交瘤细胞,通过测序得到抗HSA抗体的序列。将小泛素相关修饰物(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)标签用于scFv的表达,使用表达的泛素样特异性蛋白酶(Ubiquitin-like specific protease,Ulp1)进行标签切除,成功得到了可溶性的scFv,并对scFv进行了结构分析。主要研究成果如下:(1)通过HSA免疫小鼠进而制备得到杂交瘤细胞,抽取小鼠腹水,纯化抗体进行亲和力分析,确定1H11株杂交瘤细胞产生的抗体的亲和力最强,提取总RNA,反转录成cDNA后,测序得到抗HSA抗体的序列。将抗体的重链可变区和轻链可变区的序列通过短linker(G4S)3进行连接,得到单链抗体scFv。采用psvT7为表达载体对scFv进行表达,结果显示,scFv以包涵体的形式在大肠杆菌中低量表达。因此实验将SUMO标签用于scFv的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,通过表达条件的优化,确定最优的表达条件为为移种后7 h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.05 mmol·L-1。(2)为了进一步得到不含标签的scFv,需要使用SUMO蛋白酶进行SUMO标签的切除。首先进行了SUMO蛋白酶Ulp1的表达纯化:利用基因工程技术,合成基因ulp1,并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His6),采用psvT7为表达载体,经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7 h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1 mmol·L-1,诱导时间为16 h,最终蛋白表达量占菌体总蛋白的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190 mg·L-1,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。之后通过酶切反应,测定酶活为5.19 U·μL-1,比酶活为5.23×104 U·mg-1,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数Km=0.359 g·L-1,Vm=5.10μg·(mL·min)-1。最后将纯化的融合蛋白SUMO-scFv使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv。(3)为了进一步提高抗体的亲和性,对抗体进行了建模分析。以Fab的形式进行同源建模,除重链可变区的CDR3与已知晶体结构的一致性为53.8%以外,其余部分的一致性均高于75%,拉氏图结果表明,建模结果可靠。将Fab建模的结构与已知的HSA晶体结构进行分子对接,初步判断抗体与抗原HSA的结合部位主要在HSA的结构域Ⅲ综上,利用分子生物学技术,表达并纯化了SUMO蛋白酶Ulp1,并成功用于scFv的表达和纯化,为研制具有自主知识产权的scFv药物提供了原材料。通过抗体建模分析,初步判定抗体抗原结合位点,为实验进一步验证对接的准确性提供了方向,为以后进行虚拟氨基酸突变以提高抗体的亲和性和抗体人源化提供了依据。