荞麦胰蛋白酶抑制剂（Buckwheat Trypsin Inhibitor,BTI）是胰蛋白酶的一种竞争性抑制剂,与胰蛋白酶有特异亲和力,可用于制备亲和填料,实现一步层析法纯化胰蛋白酶。最新研究表明,BTI在体外可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,能够延缓秀丽隐杆线虫的健康寿命,具有良好的应用前景。在已解析了BTI一级序列及三维结构基础上,本研究制备了抑制活性提高的mBTI突变体,对其固定化条件进行了优化,为BTI的进一步应用提供了一定的实验参考及理论依据。本研究主要内容如下:第一部分:用体外定点突变技术制备了活性提高的突变体mBTI,并对其抑制活性进行研究。采用定点突变试剂盒,通过PCR技术构建了pQE-30-mBTI质粒,经大肠杆菌诱导表达、镍柱亲和层析纯化、葡聚糖G25凝胶柱脱盐后,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定mBTI,比较了突变体mBTI与BTI的抑制活性,又探究了三种有机试剂对mBTI抑制活性的影响。结果表明,本实验成功构建了pQE-30-mBTI质粒,经亲和层析纯化得到了电泳纯的mBTI,突变体mBTI的抑制活性明显增强。甲醇降低了BTI的抑制活性,二甲基乙酰胺和乙腈对mBTI有一定增强作用,当乙腈浓度大于40%时,增强作用会减弱。第二部分:以聚乙烯醇和海藻酸钠为载体,对mBTI进行固定化,并对其固定化条件进行优化。根据CaCl₂浓度、载体与抑制剂体积比和固定化时间三个单因素结果,设计Box-Behnken中心试验,利用响应面法对固定化条件进行优化,得到了最佳固定化条件及主要影响因素。结果表明,经响应面优化后得到最佳固定化条件为:CaCl₂浓度为5.5%,载体与抑制剂体积之比为1.6:1（mL/mL）,固定化时间为31 min,在此条件下得到固定化BTI抑制率为72.4%,与预测值74.3%相差较小,证明用响应面法优化mBTI固定化工艺条件参数准确可信,为制备mBTI缓释载体奠定了理论基础。第三部分:用三种方法制备了含mBTI的壳聚糖-海藻酸盐微球,并对其缓释性能进行研究。方法一将mBTI-海藻酸钠溶液直接滴到壳聚糖与CaCl₂的混合溶液中进行固定（一步法）;方法二是将mBTI-海藻酸钠先滴到CaCl₂溶液中,30 min后再转移到壳聚糖溶液中固定（两步法）;方法三是将两步法制备的微球再转移到海藻酸钠溶液中固定（双重交联）。结果表明,一步法制备mBTI-海藻酸钠-壳聚糖微球的包埋率比两步法、双重交联法包埋率高。制备的微球在模拟胃液和肠液中都可以缓慢释放mBTI,但在模拟肠液中的释放速率要快于模拟胃液。在0-10 min内,冻干微球的mBTI释放速率快于未冻干微球,在10 min以后,两种形态冻干微球都可以实现对mBTI的缓慢释放。