坛紫菜碳酸酐酶家族基因的克隆及表达分析

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碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,简称CA),是催化CO2可逆水合反应的一类含锌金属酶,在无机碳利用中扮演着重要的角色。坛紫菜(Pyropia haitanensis)是我国紫菜人工栽培的两个主要种类之一,对其碳酸酐酶家族基因的克隆至今未见报道。本研究采用RACE技术,以坛紫菜全转录组测序获得的Unigene序列为基础,克隆得到6条坛紫菜CA基因的全长;并采用实时定量PCR技术研究了这6条基因在不同条件下的表达水平的变化,进一步分析了坛紫菜的pH补偿点及逆境胁迫下碳酸酐酶活力的变化情况。主要的研究结果如下:1、成功克隆了6个坛紫菜CA家族基因的全长,分别命名为PhαCA1、PhαCA2、PhβCA1、PhβCA2、PhβCA3和PhγCA1。其中,PhαCA1、PhαCA2属于α碳酸酐酶家族,PhβCA1、PhβCA2和PhβCA3属于β碳酸酐酶家族,PhγCA1属于LbeatH超家族。2、研究了PhCAs基因在坛紫菜不同发育世代的表达水平,结果发现PhαCA1、PhαCA2和PhγCA1在叶状体中的表达水平显著高于丝状体;而PhβCA1、PhβCA2和PhβCA3在丝状体中的表达水平显著高于叶状体,进一步证实了坛紫菜生活史中不同世代的无机碳利用机制存在差异。3、研究了PhCAs基因在不同CO2浓度下表达水平的日变化,结果发现坛紫菜中PhγCA1和PhβCA3基因的表达水平不受CO2浓度的影响,推测PhγCA1和PhβCA3碳酸酐酶为组成型;PhαCA1、PhαCA2、PhβCA1和PhβCA2基因表达水平随CO2浓度改变发生显著性的变化;推测PhαCAl、PhαCA2、PhβCA1和PhβCA2碳酸酐酶为诱导型。4、研究了PhCAs基因在高温和失水逆境胁迫下的表达水平变化,结果发现除PhαCA2基因在高温胁迫下表达水平显著下调外,PhαCAs和PhγCA1基因在胁迫下表达水平均显著上调。说明PhαCAs和PhγCA1基因均与坛紫菜逆境胁迫应答胁迫应答密切相关。5、测定了坛紫菜不同发育世代的pH补偿点,结果发现坛紫菜叶状体的pH补偿点为9.82、丝状体pH补偿点为9.93;在添加胞外碳酸酐酶抑制剂(AZ)条件下,叶状体pH补偿点为9.28、丝状体pH补偿点为9.47。说明坛紫菜存在胞外碳酸酐酶并具有活性,也即说明坛紫菜具有直接利用HCO3-的能力。6、测定了坛紫菜碳酸酐酶在不同逆境胁迫条件下的活性变化,结果发现胞外和全部碳酸酐酶活性变化的趋势一致,但胞外碳酸酐酶应答快速并变化幅度比较大。说明逆境胁迫通过抑制碳酸酐酶的活性,进而影响坛紫菜光合作用过程中对无机碳的利用。
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