环境致癌物与肺癌的发生、发展密切相关,其致癌机制越来越受到广泛的关注。环境致癌物可引起机体某些表观遗传学的改变,在其所致的肿瘤发生和发展中发挥了重要作用。其中,microRNAs(miRNAs)已被认为肿瘤发生发展的关键调节因素,可通过转录后调控许多基因的表达影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程,促进细胞的恶性转化和肿瘤的进展。黄曲霉毒素B1(AFB1)是公认的强致癌物,广泛分布于高湿高热地区的各种粮食和饲料中,空气中的AFB1污染可能与肺癌的发生有关。AFB1系间接致癌物,可被呼吸系统中高表达的细胞色素P450 2A13代谢活化而增强其致癌能力。课题组前期采用0.1 nM AFB1处理高表达CYP2A13的肺支气管上皮细胞BEAS-2B(B-2A13)50代(P50)可引起恶性转化,但mi RNAs在此过程中的作用及其机制尚不清楚。因此,了解miRNAs在AFB1致B-2A13细胞恶性转化过程中的作用及其机制有助于全面认识miRNAs在环境致癌物所致肿瘤发生发展中的关键作用。围绕上述问题,本研究利用miRNA芯片比较了P50恶性转化的B-2A13细胞和同期对照细胞的mirnas表达谱,筛选与细胞恶性转化相关的关键mirnas;再通过功能研究评价关键mirna在细胞恶性转化中的作用及其分子调控机制;试图为阐明环境致癌物afb1与肺癌的关系提供依据,也为肺癌的预防和控制提供新的生物学标志。第一部分afb1诱导的b-2a13细胞恶性转化相关的关键mirnas的筛选目的:筛选在p50b-2a13细胞和p50b-vector细胞间差异表达的mirnas,寻找与afb1所致细胞恶性转化相关的关键mirnas。方法:采用affymetrixmirna芯片中检测afb1持续处理的恶性转化的p50b-2a13细胞和同期未转化的对照细胞(p50b-vector)的mirnas表达谱,比较两种细胞间差异表达的mirnas。采用targetscan软件预测差异表达的mirnas的靶基因,分析它们所参与的基因通路,筛选出与细胞恶性转化及肺癌发生密切相关的mirnas,采用rt-qpcr对相关mirnas进行验证。最后再采用瞬时转染mirnamimics的方法在p50b-2a13细胞中过表达mir-138-1*、mir-1271、mir-296-3p和mir-708,用细胞增殖实验和划痕实验检测它们对p50b-2a13细胞增殖和迁移的影响。结果:1.affymetrixmirna芯片分析:在p50b-2a13细胞和p50b-vector细胞间差异表达的mirnas有63个,其中上调的有36个,下调的有27个。2.targetscan软件预测:初步筛选出差异表达的mirnas共13个,其中上调的有7个,分别为mir-432、mir-382、mir-370、mir-335、mir-183、mir-494和mir-421;下调的有6个,分别为mir-138、mir-138-1*、mir-708、mir-125b-1*、mir-1271、mir-296-3p。3.rt-qpcr验证:rt-qpcr和芯片结果高度相关,除mir-370、mir-138、mir-494外,其余10个mirnas的表达改变同芯片结果方向一致。4.细胞增殖:与对照组(mir-control)相比,mir-138-1*可抑制p50b-2a13细胞的增殖,但mir-1271、mir-296-3p和mir-708对p50b-2a13细胞的增殖影响不显著。5.细胞迁移:测定的4种mirnas都能抑制细胞的迁移,其中mir-138-1*mimics处理组的抑制作用最为显著。瞬时转染mir-control、mir-138-1*、mir-1271、mir-296-3p和mir-708的p50b-2a13细胞的24h划痕愈合情况分别为47%、27%、30%、37%和32%。第二部分mir-138-1*对afb1所致的b-2a13细胞恶性转化的影响及调控机制目的:探讨mir-138-1*对afb1所致的b-2a13细胞的恶性转化过程的影响,分析mir-138-1*调控的分子机制。方法:采用瞬时转染的方法改变mir-138-1*或pdk1在p50b-2a13细胞的表达水平。用体外研究评价mir-138-1*或pdk1对p50b-2a13细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成的影响。细胞增殖实验、划痕实验、平板克隆形成、软琼脂克隆形成实验、transwell迁移实验、transwell侵袭实验、westernblot、rt-qpcr、报告基因实验等按标准操作程序进行。结果:1.mir-138-1*对p50b-2a13细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成的影响:增加mir-138-1*的表达能显著抑制p50b-2a13细胞的增殖、划痕愈合、克隆形成、迁移和侵袭。2.mir-138-1*调控的关键靶基因筛选:用rna22-has、microrna.org和diana-microt等软件对mir-138-1*的靶基因的预测结果以及rt-qpcr、westernblot和双荧光素酶报告基因实验皆显示,pdk1可能是mir-138-1*影响p50b-2a13细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成的调控靶基因,mir-138-1*对pdk1的mrna水平和蛋白质水平的表达都具有明显的抑制作用。3.pdk1对mir-138-1*表达水平的影响:rt-qpcr检测显示,sirna介导的pdk1在p50b-2a13细胞的敲除不影响mir-138-1*的表达。4.mir-138-1*对pi3k/pdk1/akt信号通路的调控:与p0b-2a13细胞、p50b-vector细胞和beas-2b细胞相比,p-pdk1、p-akt和p-gsk-3β的表达水平在p50b-2a13细胞明显增强,同样,在过表达mir-138-1*的p50b-2a13细胞,p-pdk1、p-akt和p-gsk-3β的表达水平也有减少。5.pdk1对p50b-2a13细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成的影响:在p50b-2a13细胞中敲减pdk1的表达能明显抑制细胞的增殖、划痕愈合、克隆形成、迁移和侵袭。结论1.通过miRNAs芯片和初步的功能验证,发现了63个mi RNAs与AFB1诱导的B-2A13细胞的恶性转化有关,由于mi R-138-1*能显著抑制P50 B-2A13细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成,可能是起关键作用的miRNA。2.miR-138-1*可以显著抑制P50 B-2A13细胞PDK1的表达,PDK1是miR-138-1*的靶基因之一。3.PDK1介导的PI3K/PDK1/Akt信号通路在恶性转化的P50 B-2A13细胞被激活,miR-138-1*可通过PDK1调节PI3K/PDK1/Akt信号通路的活化。4.在恶转细胞敲除PDK1可抑制P50 B-2A13细胞的增殖、划痕愈合、迁移、侵袭和克隆形成,miR-138-1*可能是通过对PDK1的调节来实现对B-2A13细胞恶性转化过程的调控。