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背景:毒邪是癌症发病的中心环节,解毒抗癌法是中医治疗癌症的有效方法,解毒抗癌方对癌症的作用机制仍不清楚。滤泡性辅助性T细胞（Tfh）在B细胞的活化中起主要作用,在前期实验中我们发现HBs Ag和CD57有密切的关系,我们认为在人体中存在CD4+CXCR5+CD57+T细胞亚群,而解毒抗癌方可以调节这一细胞亚群,在肝癌的治疗和预后中起着重要的作用。目的:解毒抗癌法是治疗癌症的有效方法,解毒抗癌方对癌症的作用机制有待阐明,本研究拟通过分析CD4+CXCR5+CD57+T细胞在肝癌中的作用及对预后的影响,探讨解毒抗癌方的抗肿瘤作用和调节CD4+CXCR5+CD57+T细胞的作用机制。方法:临床实验:按照方案筛选实验对象肝癌65例,32例健康志愿者作为对照组。肝癌手术标本行HE染色和免疫组化检测标本中CD57、HBs Ag、CXCR5等蛋白的表达;分离外周血中的淋巴细胞后加入荧光标记的CD57、CXCR5和CD4抗体,孵育后进行流式细胞检测,分析CD4+CXCR5+CD57+T细胞的表达量;血清分离后,使用ELISA方法检测IL-21、IL-6、IFN-γ、CXCL13和CXCR5的浓度;使用生化检测仪分析血清中Ig G、ALT、AST、胆红素的含量;PCR-荧光探针法检测肝癌组织中HBV-DNA表达量;采用荧光定量QPCR分析肝癌组织标本中IL-10、TGFB1、RORC、IL-17A、IL-21、IL-6、CXCR5和CD57等基因的表达量。细胞实验:取健康脐带血或外周血进行淋巴细胞分离,IL-2（300U/ml）、IL-1α（100U/ml）、IL-21（40ng/ml）进行诱导,通过磁珠筛选进行分离,之后加入CD57、CXCR5和CD4荧光标记抗体,检测CD4+CXCR5+CD57+T细胞表达量;取培养液0.5ml加入Hp G2的细胞培养液中,比例为20%,在24-48小时后进行Hp G2的凋亡检测。使用MTT法分析疏肝健脾方、解毒抗癌方、DDP对Hp G2肿瘤细胞生长的抑制作用;分离细胞培养液,使用ELISA检测L-21、IL-6、IFN-γ和CXCR5的含量。动物实验:昆明小鼠和C57BL/6购买自广东省医学实验动物中心,C57BL/6-HBV购买自上海南方模式生物研究中心,C57BL/6-Foxp3GFP购自The Jackson Laboratory。H22肝癌细胞（广东省医学实验动物中心）左前臂腋窝处注射0.1ml,48小时后给与药物干预,干预时间为10d。各组小鼠处死后,取肝、肺和接种的瘤体进行常规HE染色和免疫组化染色分析CD57、CXCL13蛋白表达;无菌分离脾脏研磨分离淋巴细胞后进行CD4+CXCR5+CD57+T细胞的流式细胞检测;ELISA检测外周血IL-21、IL-6、IFN-γ、CXCR5和CXCL13的含量;PCR荧光探针法检测HBV-DNA表达量;荧光定量RT-PCR分析IL-10、TGFB1、RORC、IL-17A、IL-21、IL-6、CXCR5、CD57等基因的表达量。统计方法:使用SPSS（statistics package for social science）19.0软件进行数据分析,定量资料如果符合正态分布,统计描述指标可用均数及标准差,如果不符合正态分布,则指标选用中位数和级差（即:最大值和最小值之差）。对于分组呈正态分布的定量资料,如为两组比较,使用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:临床实验:病理学结果检查表明,HBs Ag阳性与CD57阳性的结果符合率为83%,表明二者之间有密切的相关性;CD4+CXCR5+T细胞的数量在正常人中为5.95%,在I-IIIA期肝癌患者中为5.39%,在IIIB-IV期肝癌患者中为3.21%,正常人群和IIIB-IV期肝癌之间存在着统计学差异（P<0.05）;CD57+CXCR5+T细胞在正常人中为20.9%,在I-IIIA期肝癌患者中为13.8%,IIIB-IV期肝癌患者中为8.44%,其表达量在三者之间具有统计学意义;CD4+CD57+T细胞在正常人群为3.5%,在I-IIIA期肝癌患者中为3.18%,在IIIB-IV期肝癌患者中为2.02%,之间具有统计学差异。CD4+CXCR5+CD57+T细胞的阳性表达在正常人群为22.9%,I-IIIA期肝癌患者为8.18%,IIIB-IV期肝癌患者为2.79%,具有统计学意义。ELISA分析发现IL-21的数量则有明显的不同,INF-γ无明显的不同;RT-PCR分结果表明,Hbs Ag阳性标本中的IL-6、LI-21、IL-17A、CD57和CXCR5的基因表达明显下降,具有统计学意义。回归分析发现,CD4+CXCR5+CD57+T细胞与ALT的水平密切相关,当ALT的水平升高时,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量也随之升高,具有统计学意义,与Ig G的相互关系中发现两者密切相关,而与HBV-DNA的水平没有明显的关系;CD4+CXCR5+CD57+T细胞与生存时间的关系表明,其表达水平越多,肝癌病人的生存时间越长。细胞实验:外周血中的干细胞经IL-2、IL-21和INF-γ诱导可以分化为CD4+CXCR5+CD57+T细胞,并且随着培养时间的增加分化的细胞数量升高,占CD4+细胞数量的22%;诱导的CD4+CXCR5+CD57+T细胞可以分泌IL-6、IL-21、INF-γ,具有时间相关性,而不分泌CXCL13。流式分析发现CD4+CXCR5+CD57+T细胞在24h小时可诱导71.3%的Hp G2细胞凋亡,在48小时诱导89.2%的细胞凋亡,具有统计学意义,分析发现其机制与FAS的表达相关;诱导12d,CD4+的T细胞数量占总数的21.4%,CD4+CXCR5+T细胞的数量为5.9%,而CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量为9.7%,CD57+T细胞的数量为28.2%,随着培养时间的延长,CD4+、CD57+、CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量显著增多,具有统计学意义。疏肝健脾方的抑制率为11.1%,解毒抗癌方为72.8%,DDP为74.7%,疏肝健脾方和解毒抗癌方两组之间具有统计学差异;解毒抗癌方可以抑制IL-6的分泌;同时解毒抗癌方抑制IGF-IR的分泌,其作用与DDP相当。动物实验:解毒抗癌方能抑制肿瘤组织的生长,但是抑制作用小于DDP;C57BL/6-HBV的小鼠肝、肺可见淋巴细胞、浆细胞浸润;C57BL/6-HBV小鼠的H22,Ki67的免疫组化阳性率为80%,中药干预后期阳性率为30%,DDP为10%,IL-21阳性率为10%以下,具有统计学学意义（P<0.05）。ELISA结果显示中药可以提高IL-6、IL-21、INF-γ、CXCL13的水平,具有统计学意义。HBV可以显著的抑制CD4CXCR5的阳性表达,促使IL-6显著升高,IL-21下降,给以中药干预,CD4CXCR5的细胞数量显著的上升,DDP干预后CD4CXCR5的细胞数量减少,进行IL-21的腹腔内注射,可以使CD4CXCR5的数量显著升高。C57BL/6小鼠的CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量为6.2%,而C57BL/6-HBV的数量为2.16%,两组之间有明显的差别。给以C57BL/6-HBV接种H22细胞,在d5,d10和d14进行流式细胞学的检测,结果表明,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量没有明显的变化,给以解毒抗癌方干预,CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量显著的上升,DDP干预后CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量未见变化,IL-21干预后CD4+CXCR5+CD57+T细胞的显著上升。实时定量RT-PCR分析H22瘤体中Tfh,Th17和Treg相关基因的表达发现,在C57BL/6-HBV接种的H22瘤体IL-6、LI-21、IL-17A、CD57和CXCR5的基因表达明显下降,经解毒抗癌方干预后IL-6、IL-21、CXCR5和CD57的基因表达显著提升（P<0.01）,DDP干预后IL-6,IL-21,CXCR5,CD57的基因表达下降;基因表达分析发现,HBV显著的抑制了Tfh,Treg,Th17的相关基因表达,而在DDP和解毒抗癌方的干预方面,则有非常显著的差异,解毒抗癌方则显著的增加CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量。结论:1.CD4+CXCR5+CD57+T细胞是CD4+CXCR5+T细胞的一个亚群,具有抑制肝癌的作用,通过CD95诱导Hp G2细胞凋亡。HBV可以抑制CD4+CXCR5+T细胞和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的功能,在肝癌的形成过程中可能是一个重要的因素。2.毒邪是肝癌病因病机中的中心环节,其病变基础是毒邪可以抑制机体的免疫功能,CD4+CXCR5+CD57+T细胞和CD4+CXCR5+T细胞的功能下降使机体表现为正气亏虚。3.解毒抗癌方可以杀死Hp G2细胞,减少IL-6和IGF-IR的分泌。解毒抗癌方可显著的提高CD4+CXCR5+T细胞和CD4+CXCR5+CD57+T细胞的数量和功能,可能是其抗癌的作用机理。