研究背景外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是常见的外阴阴道感染性疾病,70-75%的性活跃期女性在一生中至少经历一次VVC,其中5%-8%的患者发展为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis RVVC),即一年内VVC发作4次或以上则称RVVC。由于它反复复发又经久不愈,严重干扰了妇女的身心健康。一般为与RVVC发生有关的因素有：①亚临床酵母菌的存在；②致病菌毒力的增强；③肠源性感染；④性传播；⑤宿主防御机能的减弱。RVVC不仅给患者生活造成影响,更重要的是,随着抗真菌药物的广泛和反复应用,使VVC越来越难治。由于致病假丝酵母菌种类的增加和光滑假丝酵母菌(Candida glabrata, C. glabrata)、克柔假丝酵母菌(Candida krusei, C. krusei)等种对临床常用抗假丝酵母菌感染药物不敏感或具有天然抗性,给假丝酵母菌感染的诊断和治疗带来了新的课题,因此致病假丝酵母菌菌株的鉴定对明确感染和传染源以协助诊断及治疗具有重要意义。外阴阴道假丝酵母菌病的主要致病茵为白假丝酵母菌(Candida albicans, C. albicans)。白假丝酵母菌致病具有多变性,可在许多解剖部位与宿主共栖生存,且每一种生存状态下都有其适应环境的特异系统。这意味着白假丝酵母菌及其它假丝酵母菌属的疾病谱超过了大多数其它共栖微生物。有研究发现,RVVC患者感染的假丝酵母菌的基因型没有变化,即总是感染同一克隆来源的菌株,且连续2次发作期间从不同的解剖部位分离出的白假丝酵母菌进行了生物分型和基因分型,结果提示大多数RVVC为内源性感染。患者分离株和其男性伴侣的外阴分离株相同或高度相关,说明阴道内优势菌株不仅能造成自身反复感染,而且可以传染给性伴。但也有研究发现针对肠道感染及性伴侣感染治疗并不能减少RVVC的复发。因此有必要对不同部位白假丝酵母菌进一步研究,以了解其致病基因型是否相同。传统的酵母菌分类主要依靠细胞形态学及一些生理生化特征,如发酵作用,同化作用及其他的生化试验,如API20和Bio-Log系统等。上述鉴定工具依靠生理生化反应等表型特征,有时难以保证鉴定的精确性。分子生物学技术的发展使分类学者可以从遗传物质(DNA)中寻找依据,为假丝酵母菌的分类学研究提供了更有效的手段。DNA碱基组成DNA-DNA(或DNA-RNA)同源性或相关性、rRNA/rDNA序列分析、脉冲电泳核型分析、随机扩增多态DNA片段等分子生物学方法在假丝酵母菌分类学研究中日益广泛的应用,很大程度上完善了我们对假丝酵母菌属的认识。其中核糖体RNA (rRNA)或核糖体DNA (rDNA)的序列分析在假丝酵母菌及酵母菌的系统分类学研究中发挥着越来越重要的作用。假丝酵母菌的rDNA基因为串状重复序列,约100～200个拷贝,包括编码28sDNA、18SDNA和5.8SDNA的基因,其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS),包括ITS1及ITS2两部分,由于进化较快,具有一定的种间特异性和种内保守性,是进行种间分类的好素材,但昂贵的测序费用限制了其应用。单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)技术的出现使这一检测技术得到广泛的应用,SSCP是基因突变分析中最常用的方法之一。其理论基础是单链DNA具有序列特异性的二级或三级构象,1个或多个碱基的变异能影响其构象,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,构象的改变表现为单链DNA迁移率的改变。因此,把双链DNA片段在加热或变性剂的作用下生成单链,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,根据各样品的单链迁移率,就可以把突变体和非突变体区分开,从而达到分离菌株的目的。白假丝酵母菌分型方法众多,其中微卫星序列多态性分析方法是一种基于PCR扩增的DNA指纹图谱分析方法。微卫星即末端短片段重复序列(short tandem repeats, STR)或短片段重复序列(shortsequence repeats, SSR),是指以少数几个核苷酸(多数为2-4个)为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同菌株间存在很大差异,因此微卫星标记可用于菌株分子分型的研究。其中白假丝酵母菌四号染色体的非编码区的微卫星序列CAI有高度多态性,通过对其进行基因扫描,可以达到0.97的分辨率,是迄今为止单位点分析所能达到的最大的分辨率。而且CAI区有很高的种特异性和重复性,在白假丝酵母菌的基因型分析中有良好的应用前景。研究目的本研究通过了解RVVC患者阴道、肛门、口腔及其性伴侣龟头分泌物假丝酵母菌菌种分布,找出RVVC患者不同部位及性伴侣感染菌种的相关性,并进一步分析主要致病菌白假丝酵母菌的基因型,了解RVVC与白假丝酵母菌基因型是否存在联系。材料和方法1.2008年7月至10月珠江医院妇产科门诊确诊为RVVC患者55例,年龄20-45岁,平均年龄(29±7)岁,入选病例无糖尿病、长期用抗生素及免疫抑制剂者。参照2004年中华妇产科学分会感染性疾病协作组关于外阴、阴道假丝酵母菌病诊治规范中评分标准对临床症状的严重程度进行评分。2.标本采集：用无菌棉签取RVVC55位患者阴道分泌物、肛门分泌物、口腔分泌物及相应的45位患者性伴侣龟头分泌物,将阴道分泌物涂10%KOH溶液悬滴镜检,高倍镜镜检可见菌丝或孢子。将新鲜标本直接接种于加有氯霉素的SDA培养基,28℃培养48-72小时后取出观察,见乳酪样菌落生长,挑选单菌落划线培养于YPD培养基,经过3次反复分离纯化后,再挑选单菌落接种于麦芽汁培养基进行活化。3.菌种鉴定：利用酶消化法提取假丝酵母菌总DNA,经过ITSl区PCR分析后,根据ITS1区SSCP电泳图谱将具有代表性的菌株进行D1／D2序列分析,PCR产物送测序公司测序,将测序结果与EMBL/DDBJ/GenBank中的已知假丝酵母菌序列比对,确定菌株种属。4.白假丝酵母菌基因型分析：所有测序后明确为白假丝酵母菌的菌株行CAI区SSCP分析,将具有不同SSCP图谱的菌株用荧光标记的CAIF引物(5’端用6-carboxyfluorescein标记)和CAIR引物重新扩增,PCR产物在ABI370分析仪上进行电泳,然后用GeneScan3.7分析软件自动分析片段的大小,以菌株ATCC90028的CAI两个等位基因位点重复片段数(27-38)为标准,确定待测菌株的CAI基因型。5.采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。组间率的差异比较采用χ2检验,若有理论数小于5则采用校正卡方检验；计量资料RVVC患者优势基因型及非优势基因型临床症状评分组间比较采用两样本t检验。以上检验均以P＜0.05为有统计学意义。研究结果1. RVVC患者阴道、肛门、口腔及性伴侣龟头分泌物假丝酵母菌培养阳性率分别为100.0%、61.8%、1.8%,60.0%,阴道分泌物标本中培养出白假丝酵母菌45株(81.8%),光滑假丝酵母菌8株(14.5%),近平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌各1株(1.8%)；肛门分泌物中白假丝酵母菌29株(82.4%),光滑假丝酵母菌4株(11.8%),近平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌1株(2.9%)；口腔分泌物中白假丝酵母菌1株；性伴侣龟头分泌物中白假丝酵母菌22株(81.5%),光滑假丝酵母菌4株(14.8%),热带假丝酵母菌1株(3.7%)。RVVC患者阴道分泌物、肛门分泌物、口腔分泌物、性伴侣龟头分泌物中各种假丝酵母菌菌株所占比率差异无统计学意义(χ2=2.371,P=0.984)。2.55例RVVC患者阴道中45株白假丝酵母菌中共有12种基因型,最常见的是CAI32-46(16株,占35.6%)和CAI30-45(12株,占26.7%),共占62.2%,呈明显优势分布,与前人报道的28株单纯型VVC患者阴道分泌物中白假丝酵母菌的优势基因型所占比率相比,差异有统计学意义(62.2%vs.35.7%；χ2=4.860,P=0.027)。3.肛门分泌物中白假丝酵母菌基因型共12种,同一患者阴道与肛门分泌物白假丝酵母菌基因型符合率为86.2%；性伴侣龟头分泌物中白假丝酵母菌基因型共10种,阴道与性伴侣龟头分泌物白假丝酵母菌基因型符合率为54.5%。4.白假丝酵母菌优势基因型与非优势基因型对应的RVVC患者临床VVC评分相比,差异无统计学意义(t=0.238,P=0.813)。结论1. RVVC患者阴道、肛门及性伴侣龟头分泌物中的假丝酵母菌分布基本相同,仍以白假丝酵母菌为主,非白念中以光滑假丝酵母菌多见。2.白假丝酵母菌基因型CAI30-45和CAI32-46为优势基因型,但与RVVC患者临床症状严重程度无相关性,说明这两种基因型与VVC的反复复发相关。3.肠源性感染及性传播在RVVC复发中起一定的作用,因此全身治疗及性伴侣同时治疗是有意义的。