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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国热带亚热带地区重要的经济型木本果树,具有极高的食用及药用价值,但是龙眼在生产上存在诸多限制其产业发展的问题。研究发现龙眼果实的产量、品质等与龙眼胚胎发育有着密切的关系,因此龙眼胚胎发育的研究具有重要意义。mi RNA（micro RNA）是一类21～24个核酸长度的小分子,在植物生长发育过程中起着重要作用。mi RNA的形成和作用机制需要很多基因的参与,且龙眼体胚中24nt的mi RNA序列最多。有研究表明一定程度的DNA甲基化有利于植物胚胎的正常发育,其中lmi RNA（long mi RNA）与DNA甲基化密切相关,其中Argonaute4蛋白在龙眼体胚发生中的功能尚不明确。本研究拟借助龙眼体胚发生系统,进行mi RNA合成途径相关基因的鉴定与分析、启动子分析、体胚不同阶段以及外源激素和非生物胁迫处理下的表达模式分析、Dl AGO4亚细胞定位分析以及沉默Dl AGO4对龙眼体胚发生早期形态建成影响的研究。主要研究结果如下:1龙眼mi RNA合成途径相关基因的鉴定和生物信息学分析从龙眼基因组中鉴定得到15条相关基因,分别命名为Dl DDL1、Dl DDL2、Dl DDL3、Dl DCL1、Dl SE、Dl HYL1a、Dl HYL1b、Dl HYL1c、Dl CBP20、Dl CBP80、Dl HEN1、Dl HASTY、Dl DCL3、Dl AGO4、Dl DRM2。生物信息学分析表明:Dl DDL1、Dl HYL1a、Dl HYL1c、Dl SE和Dl AGO4为碱性蛋白,其余成员均为酸性蛋白;除Dl HASTY为疏水性蛋白外,其余成员均为亲水性蛋白;所有基因均为不稳定蛋白;15条基因精确定位在8条染色体上;Dl CBP80为分泌蛋白,其余成员均不属于分泌蛋白;除Dl DDLs蛋白的三个成员不含跨膜结构外,其余蛋白均具有多个跨膜结构;蛋白保守结构域的结果显示各个成员均含有其典型结构域;蛋白互作分析表明,mi RNA合成途径相关基因之间具有较强的互作关系;不同基因与其它物种间在进化上呈现不同的远近关系;mi RNA合成途径相关基因在龙眼体细胞早期发育过程中呈现出不同的表达模式,提示不同成员在龙眼体胚发生早期具有不同的功能分工和特点。2龙眼mi RNA合成途径相关基因启动子分析在龙眼基因组中提取上述基因起始密码子ATG上游2000bp序列进行启动子分析。顺式作用元件分析发现:mi RNA合成途径相关基因均含有大量TATA-box和CAAT-box,表明均可以进行正常的转录,同时还包含各种光学响应元件、激素响应元件;同时还含有与细胞周期、昼夜控制、干旱、胁迫、胚乳、分生组织、低温等作用元件,提示这些基因可能参与激素应答、胁迫响应、光响应、生物钟、抗旱抗寒、种子生长、胚胎发育等过程。3龙眼mi RNA合成途径相关基因表达模式分析15条基因在龙眼体胚发生早期三个阶段的表达趋势有着明显的不同。其中Dl DDL1、Dl HYL1b不表达,Dl DDL2、Dl DDL3表达比较平稳,Dl SE、Dl HYL1c、Dl CBP80、Dl HEN1呈现先下降后上升的趋势,Dl HYL1a、Dl CBP20、Dl HASTY呈现下降趋势,Dl DCL1、Dl DCL3呈现下降趋势,Dl AGO4、Dl DRM2呈现先上升后下降的趋势,其中Dl AGO4在三个阶段表达量均为最高,推测Dl AGO4在龙眼体胚早期发生重要作用。在外源激素ABA处理24h后Dl HYL1c和Dl DCL3的表达量呈现明显上调;Me JA处理4h后Dl DDL2、Dl DDL3、Dl DCL1、Dl SE、Dl HYL1c、Dl CBP20的表达量均呈现明显上调,处理12h后Dl CBP80表达量出现明显上调,Dl DCL3在整个时间处理中表达量均上调;SA处理24h后Dl HYL1c表达量上升,Dl DDL3、Dl DCL1、Dl CBP80、Dl HASTY、Dl DCL3在处理48h后表达量明显上升;GA3处理4h后Dl DDL3、Dl DCL1、Dl HYL1c表达量上调,Dl DDL2在8h处表达量上调,Dl CBP80和Dl DCL3分别在24h和48h处表达量明显上调,表明龙眼mi RNA合成途径相关基因在外源激素处理下有不同的应答机制。经盐胁迫处理后,Dl DDL2和Dl SE在50mmol/L和100mmol/L浓度下表达量明显升高,Dl DDL3在50mmol/L浓度下表达量升高,Dl HYL1c在100mmol/L和200mmol/L浓度下表达量升高,其余处理表达量均下降表现为负调控。10%的PEG6000处理下,Dl DCL1在8h出表达量升高,Dl DDL2在12h和24h处表达量升高,Dl DDL3、Dl SE、Dl HYL1a、Dl DCL3在24h处表达量升高,Dl HYL1c在8h、12h、24h、48h表达量均有明显升高,其余处理下表达量明显降低表现为负调控。上述结果表明龙眼mi RNA合成途径相关基因广泛参与不同非生物胁迫,但不同成员的应答模式不同。4龙眼Dl AGO4的亚细胞定位研究采用Wo LF PSORT在线网站预测龙眼Dl AGO4可能定位于细胞核。同时,在龙眼Dl AGO4 c DNA全长序列的基础上构建了1302-Dl AGO4-GFP表达载体,采用农杆菌注射法侵染烟草叶片,在激光共聚焦显微镜下观察烟草叶片中的荧光。结果表明:龙眼Dl AGO4定位于细胞核,与预测结果一致。该结果为进一步探究该基因的功能奠定基础。5 Dl AGO4基因沉默对龙眼体胚发生早期形态发生的影响根据Dl AGO4基因的ORF序列设计并合成用于敲除靶基因的Si RNA,筛选抑制效果最好的靶点477进行龙眼愈伤组织转化实验结果表明:抑制Dl AGO4后与对照组相比,出现球形胚时间稍微提前,表明抑制Dl AGO4后龙眼体胚发生早期分化速度加快,推测这可能与降低龙眼体胚发生早期甲基化水平有关。