寻找和开发有效的抗癌活性物质是肿瘤治疗研究热点之一。拓扑异构酶Ⅱ抑制剂氨萘非特作为一种传统的抗肿瘤萘酰亚胺类衍生物,由于其毒副作用止步于临床研究,但其显著抗肿瘤活性的化学结构为新的抗肿瘤药物设计提供结构基础。在先前的研究中,一种新型氨萘非特类似物B1由于其显著的抗肿瘤作用、较低的毒副作用引起肿瘤治疗学领域的关注。研究和开发新型的萘酰亚胺类衍生物,对于开发新的抗肿瘤药物和治疗方法均具有十分重要的意义。为了明确化合物B1作用机制和分子靶点,从而为该化合物的临床应用提供实验基础,也为进一步的开发研究抗肿瘤新药提供科学基础,本课题从肿瘤分子细胞药理学的研究领域探索该化合物的抗肿瘤效应和机制。本研究利用MTT方法,克隆形成的方法检测B1对多种肿瘤细胞增殖的影响。结果表明,B1具有广谱的抗肿瘤活性,对多种细胞具有生长抑制作用,而且对人正常细胞的毒性明显小于肿瘤细胞,有良好的选择毒性,不同细胞对B1作用的敏感程度不同,HeLa细胞最敏感,其次是MCF7,HL60。首先,本研究表明B1通过诱导细胞周期阻滞和凋亡抑制HeLa细胞生长。流式细胞分析和western blot方法检测结果表明B1依赖于p53信号通路以浓度和剂量依赖性地诱导HeLa细胞周期阻滞和凋亡。同时B1作用HeLa细胞后,通过共聚焦显微镜可观察到细胞色素C从线粒体释放。这些实验表明B1的抗肿瘤活性与p53活化和细胞色素C释放有关,为其进一步的药理药效学研究奠定了基础。Bcl-2家族包括很多凋亡调节因子,如抗凋亡蛋白Bcl-2。由于其能改变凋亡敏感性的特性,研究抗肿瘤化学疗法中Bcl-2的调控机制是非常必要的。萘酰亚胺类DNA嵌入剂的治疗通常导致Bcl-2的下调,如M2-A和R16。研究表明,B1依赖于p53诱导Bcl-2下调。B1诱导凋亡的过程中,由于Bcl-2转录和启动子活性抑制,致使Bcl-2蛋白和mRNA水平下调。进一步研究p53在Bcl-2转录下调中的作用,染色质免疫沉淀实验结果表明B1作用HeLa和MCF-7细胞,p53和Bcl-2 P2启动子TATA框结合能力增加。这些结果表明B1诱导的不依赖于caspase家族的MCF-7细胞凋亡与p53活化和Bcl-2下调有关,进一步证实了萘酰亚胺类衍生物治疗中p53与Bcl-2转录水平的联系。Bcl-2基因是一种抑制细胞凋亡的原癌基因,同时也是一种耐药基因。在一些临床前研究中,Bcl-2过表达与一些肿瘤的生成和耐药性密切相关,尤其是对于白血病细胞。当Bcl-2蛋白过度表达时,可引起细胞不死亡或死亡率下降的抗凋亡作用,从而对抗药物的治疗,使化疗药物失去效果。即Bcl-2导致耐药主要是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径而完成。因此进一步检测B1是否能克服Bcl-2过表达引起的细胞耐药。存活率实验表明B1能够克服Bcl-2过表达引起的HL60细胞耐药。免疫荧光实验、Annexin V-FITC/PI双染实验、线粒体膜电位实验等一系列凋亡检测实验结果表明B1通过诱导细胞凋亡克服Bcl-2过表达引起的HL60细胞耐药。免疫印迹和免疫共沉淀实验揭示14-3-3σ下调以及随后的14-3-3σ/Bad信号通路调节、Bax/Bcl-2比率增加在B1诱导的HL60和HL60/Bcl-2细胞凋亡过程中扮演着重要作用。染色质免疫沉淀实验结果表明MBD2与甲基化的14-3-36启动子CpG岛结合,干扰其甲基化启动子的转录活性。进而,通过转染siRNA沉默MBD2,抑制B1诱导的细胞凋亡和克服Bcl-2过表达引起的细胞耐药能力。这些数据表明MBD2在B1诱导的HL60和HL60/Bcl-2细胞凋亡中扮演着重要作用。本研究分别从体外的细胞和分子水平等几个方面对萘酰亚胺类衍生物合物B1的抗肿瘤作用进行了多方面、多角度的研究,揭示了B1抑制肿瘤增殖的作用机制和具体靶蛋白。结果表明B1通过活化p53、下调Bcl-2诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡,通过MBD2和14-3-3σ/Bad信号通路克服Bcl-2过表达引起的HL60细胞耐药。以上实验结果为B1的安全性评估等临床前研究工作及专利的形成和进入临床研究提供实验基础,也为进一步的开发研究抗肿瘤新药提供科学基础,拓宽了抗癌药物的研发思路。