[背景与目的]脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FASN)是脂肪酸生物合成过程中将小分子碳单位聚合成长链脂肪酸的关键酶,能够调控内源性脂肪酸的合成,其主要产物是软脂酸,并且以甘油三酯的形式存储能量,主要参与磷脂合成、细胞膜构造、肺表面活性物质生成、细胞内信号传导以及蛋白质酰化等。众多研究表明FASN在大部分正常组织中呈现不表达或仅微量表达,而在多种恶性肿瘤组织中表达则明显上调。目前有文献报道FASN介导的物质代谢异常在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。人类结直肠癌中FASN表达的差异是否与肿瘤的发生发展以及增殖、侵袭、迁移等生物学行为存在相关性需深入探究。本研究旨在探讨FASN表达与结直肠肿瘤临床演进及肿瘤细胞恶性生物学行为的相关性,以期进一步阐明FASN与结直肠癌发生发展的相关性,为结直肠癌的防治提供实验和理论依据。[方法]1.收集临床病理石蜡标本及其临床病理资料,用免疫组织化学技术检测71例结直肠癌组织中FASN蛋白的表达状态,并分析其与结直肠癌病理类型、临床分期及预后的相关性；2.收集临床血浆标本,酶联免疫吸附法检测74例结直肠癌患者血浆中FASN的浓度,分析其与结直肠癌病理类型、临床分期及预后的相关性；3. Real-time定量检测Caco-2、HT-29、LoVo和LS174T四种结直肠癌细胞株中FASNmRNA的表达,筛选出]ASNmRNA高表达细胞株作为靶细胞进行RNAi。构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR重组干扰质粒和阴性对照质粒,测序鉴定,瞬时转染靶细胞,采用real-time定量检测转染细胞内FASNmRNA的表达水平,评价干扰效果,建立稳定转染细胞株,Real-time定量和Western blot技术检测转染细胞株中FASNmRNA和蛋白的表达水平。MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验检测转染细胞株增殖、侵袭和迁移能力的改变；4.建立裸鼠移植瘤模型,观察转染细胞株裸鼠体内成瘤情况,移植瘤组织H.E.染色,观察肿瘤病理组织形态；免疫组织化学技术检测移植瘤组织中FASN蛋白表达水平的变化。[结果]1.免疫组织化学(S-P法)结果显示：56例结直肠癌组织FASN蛋白阳性表达,占79%(其中38例阳性,占54%；18例强阳性,占25%)；15例结直肠癌组织FASN蛋白阴性表达,占21%。在大多数癌组织中FASN蛋白的阳性信号强烈,表现为弥漫性的细胞胞浆着色；在癌旁组织中的腺体细胞细胞浆中,可见少量FASN蛋白的阳性信号；而在远端的肠组织中,未见FASN蛋白阳性信号。溃疡型癌组织FASN蛋白阳性表达率55%(22/40),强阳性表达率35%(14/40)；隆起型癌组织FASN蛋白阳性表达率52%(16/31),强阳性表达率13%(4/31)；两组间FASN蛋白表达率有显著差异(P=0.012)。高分化癌组织FASN蛋白阳性表达率20%(1/5),强阳性表达率0%(0/5)；中分化癌组织FASN蛋白阳性表达率71%(27/38),强阳性表达率16%(6/38)；低分化癌组织FASN蛋白阳性表达率36%(10/28),强阳性表达率43%(12/28)；三组间FASN蛋白表达率比较呈显著差异(P<0.05)。T1+T2期癌组织FASN蛋白阳性表达率36%(4/11),强阳性表达率9%(1/11)；T3+T4期癌组织FASN蛋白阳性表达率57%(34/60),强阳性表达率28%(17/60)；两组间FASN蛋白表达率比较呈显著差异(P=0.011)。无淋巴转移患者癌组织FASN蛋白阳性表达率63%(27/43),强阳性表达率14%(6/43)；有淋巴转移患者癌组织FASN蛋白阳性表达率39%(11/28),强阳性表达率43%(12/28)；两组间FASN蛋白表达率比较呈显著差异(P=0.023)。无远处转移患者癌组织FASN蛋白阳性表达率57%(36/63),强阳性表达率19%(12/63)；有远处转移患者癌组织FASN蛋白阳性表达率25%(2/8),强阳性表达率75%(6/8);两组间FASN蛋白表达率比较呈显著差异(P=0.002)。临床分期Ⅰ+Ⅱ期病人癌组织FASN蛋白阳性表达率52%(22/42),强阳性表达率17%(7/42)；Ⅲ+Ⅳ期病人癌组织FASN蛋白阳性表达率55%((16/29),强阳性表达率38%(11/29)；两组间FASN蛋白表达率比较呈显著差异(P=0.020)。71例直结肠癌患者,根据癌组织中FASN蛋白表达阴性、阳性及强阳性分为三组,随访发现总生存率：直结肠癌FASN阴性患者1年、2年、5年的生存率分别是86.7%、79.4%、68.1%,平均生存期是47.0±5.5月；直结肠癌FASN阳性患者1年、2年、5年的生存率分别是62.2%、48.1%、48.1%,平均生存期是34.1±4.3月,中位生存期是23.0月；直结肠癌FASN强阳性患者1年、2年、5年的生存率分别是50.0%、36.8%、21.9%,平均生存期是23.1±5.2月,中位生存期是10.0±5.0月；三组间总生存率比较有显著差异(P=0.025)。直结肠癌FASN阴性患者1年、2年、5年的无病生存率分别是80.0%、64.6%、64.6%,平均无病生存期是42.6±6.3月；直结肠癌FASN阳性患者1年、2年、5年的无病生存率分别是47.2%、39.9%、35.4%,平均无病生存期是26.9±±4.3月,无病中位生存期是10.0±±8.5月；直结肠癌FASN强阳性患者1年、2年、5年的无病生存率分别是33.3%、20.8%、13.9%,平均无病生存期是15.2±±4.7月,无病中位生存期是5.0±±3.2月；三组间无病生存率比较有显著差异(P=0.010)2.酶联免疫吸附法检测结果显示：结直肠癌患者血浆FASN平均浓度为0.82±±0.56units/L,健康人血浆FASN平均浓度为0.38±0.25units/L,两组间有显著差异(P=0.000)。T]+T2期患者血浆FASN平均浓度为0.57±0.22units/L,T3+T4期患者血浆FASN平均浓度为0.87±±0.60units/L,两组间有显著差异(P=0.003)。有淋巴结转移患者血浆FASN平均浓度为1.14±0.68units/L,无淋巴结转移患者血浆FASN平均浓度为0.62±±0.35units/L,两组间比较有显著差异(P=0.001)。有远处转移患者血浆FASN平均浓度为1.36±0.58units/L,无远处转移患者血浆FASN平均浓度为0.75±0.52units/L,两组间比较有显著差异(P=0.002)。临床分期Ⅰ+Ⅱ期患者血浆FASN平均浓度为0.62±0.36 units/L;Ⅲ+Ⅳ期患者血浆FASN平均浓度为1.12±±0.68units/L,两组间比较有显著差异(P=0.000)。74例结直肠癌患者,血浆FASN平均浓度为0.82±0.56 units/L,以0.82units/L为界值,将病人按血浆FASN浓度高于或低于界值分为两组,随访5年,记录无病生存时间及总生存时间,然后在两组间进行比较分析,结果显示：低FASN血浆浓度直结肠癌患者1年、2年、5年的生存率分别是76.5%、65.0%、60.7%,平均生存期是41.8±±3.8月；高FASN血浆浓度直结肠癌患者1年、2年、5年的生存率分别是51.2%、39.6%、23.5%,平均生存期是24.6±4.2个月,中位生存期是14.0±±4.9月；两组间总生存率比较有显著差异(P=0.003)。低FASN血浆浓度直结肠癌患者1年、2年、5年无病生存率分别是65.0%、53.5%、49.7%,平均无病生存期是35.0±4.1月,中位无病生存期是28.0月;高FASN血浆浓度直结肠癌患者1年、2年、5年的无病生存率分别是35.5%、27.9%、20.0%,平均无病生存期是18.3±4.0月,中位无病生存期是6.0±2.4月；两组间无病生存率比较有显著差异(P=0.003)。3. Real-time定量检测结果显示,四株结直肠癌细胞中,LS174T的FASN mRNA表达量最低,以其为对照,Caco-2、HT-29、LoVo、的FASN mRNA表达量分别为LS 174T的FASN mRNA表达量的56.11±15.35、28.46±9.56、79.98±11.03倍。经过测序比对,克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致,因此干扰载体构建成功。用构建成功的阴性干扰质粒分别瞬时转染Caco-2、HT-29、LoVo细胞后,结果显示Caco-2细胞的转染效率高,而LoVo及HT-29细胞的转染效率不佳,选取Caco-2细胞作为靶细胞进行后续实验。用构建成功的FASN干扰质粒瞬时转染Caco-2细胞,实时定量PCR检测结果显示,该干扰载体的基因沉默效果佳,因此选用该质粒建立稳定转染细胞株。实时定量PCR和Western blot结果显示,FASN干扰载体稳定转染Caco-2细胞后,下调了Caco-2细胞内FASNmRNA和蛋白的表达水平。MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验结果显示,通过FASN-RNAi下调了Caco-2细胞内FASN的表达后,FASN-RNAi组肿瘤细胞培养96h后的OD值为0.74±0.11,克隆形成率为(5.83±1.93)%,培养24h后侵袭细胞数量为95±9.46个细胞/200倍视野,与阴性对照组及空白对照组相比,FASN-RNAi组肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力均明显减低(P<0.05)。4.动物实验显示：接种后的12只裸鼠,转染阴性对照干扰质粒Caco-2细胞组6只裸鼠全部成瘤,成瘤率为100%；转染FASN干扰质粒Caco-2细胞组6只裸鼠5只成瘤,成瘤率为83%。转染阴性对照干扰质粒组裸鼠平均成瘤时间为10.2±1.9d,转染FASN干扰质粒组裸鼠平均成瘤时间为12.8±1.3d,两组平均成瘤时间间比较有显著差异(P<0.01)。种植后第18d时,阴性对照组肿瘤平均体积为284.68±115.50mm3,FASN干扰组肿瘤平均体积为94.58±62.69mm3,组间平均体积比较有显著差异(P<0.01)。各肿瘤组织常规取材,H.E.染色后,可见移植瘤内肿瘤细胞排列成条索状、片状,部分肿瘤组织内可见小片坏死灶。免疫组织化学染色结果所示,FASN-RNAi组内FASN蛋白的表达明显低于阴性对照组(P<0.05)。l结论]1.在结直肠癌癌组织中FASN呈高表达,结直肠癌患者血浆FASN水平显著高于健康人血浆FASN水平。2.在溃疡型结直肠癌癌组织、中分化及低分化结直肠癌癌组织中FASN阳性表达率显著升高于隆起型结直肠癌癌组织及高分化结直肠癌癌组织。3.在肿瘤浸润范围为T3+T4的、有淋巴转移的、有远处转移的及临床Ⅲ期+Ⅳ期的患者癌组织中的FASN阳性表达率及血浆中的FASN浓度显著升高于T1+T2的、无淋巴转移的、无远处转移的以及临床Ⅰ期+Ⅱ期的患者。4.直结肠癌癌组织FASN阴性患者组及低血浆FASN浓度(<0.82units/L)直结肠癌患者的总生存率及无病生存率均显著高于直结肠癌癌组织FASN阳性患者组及高血浆FASN浓度(>0.82units/L)直结肠癌患者。5.利用RNAi技术成功下调结直肠癌Caco-2细胞中FASN的表达后,细胞水平和动物实验水平的研究结果均显示,FASN表达的下调能抑制肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭能力,提示FASN的表达与Caco-2细胞的恶性生物学行为相关。综上研究结果提示：结直肠癌癌组织中FASN阳性表达与结直肠癌恶性生物学行为以及预后密切相关,FASN可作为结直肠癌诊治中的特异性肿瘤标志物及分子新靶点。