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目的1、研究靶向survivin的小分子干扰RNA(siRNA)阻断膀胱癌细胞凋亡信号通路的效应,并探讨survivin基因抗凋亡机制。2、探讨转染靶向survivin的siRNA对膀胱癌生物学行为的影响及潜在的治疗作用。3、构建靶向survivin的siRNA真核表达载体。方法1、设计、合成一对survivin编码基因序列特异的小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体包裹转染T24膀胱癌细胞,分不同的浓度组(50-200 nmol/L)。MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪测定细胞凋亡率,实时定量PCR检测survivin基因和caspase3基因mRNA表达。2、建立膀胱癌T24细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分4组,实验各组分别瘤内注射生理盐水、5μg siRNA、50μg siRNA、50μg MMC,通过测量治疗前后肿瘤的体积和病理变化观察不同剂量siRNA治疗效果并与MMC比较并分析处理后裸鼠外周血肝肾功能变化。3、设计合成靶向survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6.1/Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin。结果1、survivin编码基因序列特异性siRNA能有效下调survivin基因表达水平,并呈剂量和时间依赖性,最大效应浓度为100nmol/L,此时与对照相比survivin表达水平下调75.91﹪,并显著的抑制了细胞生长,抑制率达55.29﹪,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,caspase3 mRNA表达水平明显上升达239.80﹪,细胞凋亡率亦增加至45.70﹪,与对照相比差异有统计学意义(P<0.05)。2、在建立的膀胱癌T24细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,采用不同的处理后,肿瘤的生长率各不相同。50μg MMC处理组和50μgsiRNA处理组与对照组相比差别均有统计学意义(P<0.01),50μg MMC处理组和50μgsiRNA处理组之间差别无统计学意义(P=0.548),5μgsiRNA处理组与对照组相比差别无统计学意义(P=0.486)。3、PCR、酶切鉴定、DNA测序验证了表达质粒构建成功,无碱基突变。结论1、siRNA-survivin能显著下调膀胱癌细胞survivin基因表达水平,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,可能成为膀胱癌基因治疗的新工具。2、survivin基因可能是通过下调caspase3表达来抑制凋亡。3、成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin。4、通过构建载体导入细胞,在细胞内转录产生的siRNA与化学合成的siRNA作用一致,且其转染率高,作用时间长,费用低,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。