论文部分内容阅读
背景:多囊卵巢综合症(polycystic ovary syndrome,PCOS)是影响全球9%~15%育龄女性的内分泌代谢综合征,主要表现为高雄激素血症、无排卵或寡排卵、胰岛素抵抗、肥胖以及代谢综合征等,其中高雄激素血症是诱发多囊卵巢最关键的因素之一。雄激素的生物学效应发挥作用需要与雄激素受体(AR)结合,然而雄激素/AR信号通路影响颗粒细胞凋亡的确切机制目前尚不清楚。研究发现,作为长寿基因的klotho在肾脏中可以与AR结合,并且在PCOS进程中参与了颗粒细胞的凋亡过程,但在卵巢颗粒细胞中雄激素是否通过AR直接调节klotho影响细胞凋亡的研究目前尚未报道。本课题旨在研究AR和klotho在PCOS颗粒细胞凋亡过程中的影响,为临床检测指标及治疗方法提供基础依据。方法:1)复制PCOS大鼠模型,采用阴道涂片监测大鼠动情周期、全自动生化分析仪检测大鼠血清中睾酮及血脂四项含量、苏木素-伊红染色观察大鼠卵巢组织形态学变化、免疫组织化学(IHC)和Western blot检测大鼠卵巢中AR、klotho表达的变化;2)采用不同浓度(5~100 nmol/L)TP处理人卵巢颗粒细胞系(KGN)12~48小时,CCK-8试剂盒检测细胞的活力;3)干预AR表达后,采用Hoechst以及流式细胞术检测细胞凋亡变化;IHC和Western blot检测AR、klotho表达的变化;4)沉默klotho表达后,采用Hoechst以及流式细胞术检测细胞凋亡变化;5)采用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测AR是否与klotho启动子结合。结果:1)与对照组相比,TP处理的大鼠动情周期紊乱、T显著升高(P<0.01)、血脂异常表现为HDL水平降低(P<0.05)和CHO水平增高(P<0.05)、卵巢呈多囊样改变、黄体生成减少甚至消失,经氟他胺处理后,与PCOS组相比,大鼠动情周期恢复、雄激素显著降低(P<0.01)、血脂水平改善、卵巢内可见各级卵泡、有大量黄体产生,提示氟他胺处理后卵巢可恢复正常排卵。2)与对照组相比,PCOS大鼠中AR和klotho表达均上调(P<0.05),但是氟他胺可以逆转这种情况。3)通过CCK-8、Hoechst和流式细胞术发现TP抑制KGN细胞的增殖活力,且TP能促进颗粒细胞凋亡,经过干预AR或沉默klotho后显著抑制KGN细胞凋亡,提示干预AR或klotho表达后可改善颗粒细胞的凋亡;IHC及WB发现干预AR后,AR和klotho表达均受抑制。4)ChIP分析发现klotho基因的启动子区域并未与雄激素受体直接结合。结论:雄激素通过AR上调卵巢klotho的表达,诱导颗粒细胞凋亡,促进PCOS发生发展。