论文部分内容阅读
第一部分靶向氨肽酶N和整合素αvβ3的多肽异二聚体分子影像探针在乳腺癌成像中的实验研究
目的：整合素αvβ3和氨肽酶N(aminopeptidase N, APN/CD13)是参与调节血管生成、肿瘤增殖、侵袭和转移的两个重要靶标。本研究中，我们设计并制备了一个多肽异二聚体探针68Ga-NGR-RGD，其由NGR(天冬-甘-精氨酸，Asp-Gly-Arg)和RGD(精-甘-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)多肽组成，分别靶向CD13和整合素ανβ3。将该异二聚体探针与相应的单靶向探针68Ga-NGR、68Ga-RGD进行比较，探索双受体靶向的异二聚体探针在乳腺癌显像中的可行性和优势。
方法：用双功能螯合剂NO2AtBu-N3修饰NGR多肽，通过无铜点击化学的方法偶联BCN-PEG4-c(RGDyK)。所得前体c(RGDyK)-PEG4-NOTA-click-PEG4-c(CNG RC)((简称为NGR-RGD)经纯化之后用68Ga标记。用放射分析型高效液相色谱(analyticalradio-highperformanceliquidchromatography,radio-HPLC)鉴定，并考察该探针的体内、外稳定性。用人乳腺癌细胞系MCF-7进行68Ga-NGR-RGD、68Ga-NGR和68Ga-RGD的体外细胞摄取及阻断实验。同时，用MCF-7皮下移植瘤模型鼠进行三种探针的小动物PET/CT显像及显像后的生物分布研究。选用4种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和MX-1进行68Ga-NGR-RGD的细胞摄取实验以及皮下移植瘤模型鼠显像和生物分布研究。制备乳腺癌肺转移模型，应用68Ga-NGR-RGD进行显像。分别通过蛋白免疫印迹分析和免疫组化染色鉴定细胞和肿瘤组织CD13、整合素ανβ3和CD31的表达。
结果：我们成功设计并制备了多肽异二聚体探针68Ga-NGR-RGD，其标记率及放化纯均大于99%(n=6)，比活度为45~100MBq/nmol(n=6)，体内、外稳定性好。MCF-7细胞相对高表达CD13和整合素αν，弱表达整合素β3；MDA-MB-231细胞高表达整合素αν，低表达整合素β3，不表达CD13；MDA-MB-468细胞弱表达CD13和整合素β3，高表达整合素αν；MX-1细胞不表达CD13、整合素αν和β3。细胞实验显示：MCF-7细胞对68Ga-NGR-RGD的摄取均明显高于单靶向探针68Ga-NGR(P<0.001)和68Ga-RGD(P<0.001)，且MCF-7细胞对68Ga-NGR-RGD的摄取均可被过量未标记的NGR-RGD、NGR+RGD、NGR及RGD阻断。2h时，68Ga-NGR-RGD在四种细胞中的摄取值MCF7>MDA-MB-231(P<0.01)>MDA-MB-468(P<0.001)>MX-1(P<0.001)。小动物PET/CT显像显示：注射68Ga-NGR-RGD30min后，MCF-7模型鼠肿瘤清晰可见。注射68Ga-RGD30min后，MCF-7肿瘤显影较双靶探针弱，而注射68Ga-NGR30min后，肿瘤隐约可见。当68Ga-NGR-RGD与阻断剂(RGD、NGR、NGR+RGD及NGR-RGD)共注射30min后，MCF-7肿瘤显影均不如未阻断清晰。体内生物分布研究结果与PET/CT显像结果一致。肿瘤组织CD13和整合素ανβ3免疫组化结果与细胞免疫印迹分析一致。68Ga-NGR-RGDPET/CT可以清晰显示MCF-7肺转移模型鼠的肺部转移病灶。
结论：我们成功设计并制备了双受体靶向探针68Ga-NGR-RGD，并显示该探针在乳腺癌动物模型中，相较于相应的单靶探针具有更高的肿瘤摄取、更高的靶向效率和更长的肿瘤滞留，并且可以清晰探测肺部转移病灶，具有良好的临床转化前景。
第二部分靶向CXCR4和整合素αⅴβ3的多肽异二聚体分子影像探针用于胰腺癌成像的实验研究
目的：CXC趋化因子受体4型(C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)和整合素αvβ3在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中起重要作用，在人类多种癌症中过表达。与单靶同类探针相比，能够识别多个靶标的探针可以实现更高的靶向效率。本研究中，我们将CXCR4拮抗剂，小分子环肽cyclo(D-Tyr-N-Me-D-Lys-Arg-2-Nal-Gly)(简称为yG5)，FC131肽的类似物，与c(RGDyK)相连得到异二聚体cyclo(D-Tyr-N-Me-D-Lys-Arg-2-Nal-Gly)-NOTA-click-PEG4-c(RGDyK)((简称为NOTA-yG5-RGD)并用68Ga标记，制备双受体靶向探针68Ga-yG5-RGD用于胰腺癌显像研究，并与相应的单靶探针进行比较，以探索制备的双靶探针68Ga-yG5-RGD在胰腺癌探测中的可行性和优势。
方法：通过无铜点击化学的方法将yG5与RGD相连，经HPLC纯化后得到前体yG5-RGD并用高分辨质谱进行表征。用放射性核素68Ga标记，通过分析型radio-HPLC鉴定并考察其体内外稳定性。通过蛋白免疫印迹法和免疫组织化学染色分析分别表征人胰腺癌细胞BXPC3、人乳腺癌细胞MX-1及相应的肿瘤组织CXCR4和整合素αvβ3的相对表达水平。体外细胞实验和在体BXPC3、MX-1荷瘤鼠模型PET/CT显像及生物分布研究来评价68Ga-yG5-RGD在胰腺癌显像中的应用，并与相应的单靶探针进行比较研究。
结果：本研究成功构建了多肽异二聚体yG5-RGD，并用68Ga进行放射性标记，比活度为74~92MBq/nmol(n=6)，标记率及放化纯均大于99%。68Ga-yG5-RGD在PBS和新鲜人血清中于37℃孵育2h后，放化纯仍大于99%。将68Ga-yG5-RGD经尾静脉注入小鼠体内，2h后取尿液分析，探针未见明显脱标及降解。BXPC3相对高表达CXCR4和整合素αvβ3，而MX-1极低表达或不表达。体外细胞实验显示，BXPC3对68Ga-yG5-RGD的摄取显著高于对68Ga-yG5(P<0.001)和68Ga-RGD(P<0.001)的摄取，且能被过量的AMD3100(FDA批准的CXCR4拮抗剂)、RGD及AMD3100+RGD阻断。小动物PET/CT显像显示，68Ga-yG5-RGD主要经肝脏和肾脏代谢。在观察时间内，注射68Ga-yG5-RGD后，BXPC3肿瘤显影较注射68Ga-yG5和68Ga-RGD清晰。此外，注射68Ga-yG5-RGD2h时，BXPC3肿瘤仍清晰可见。阻断研究表明，共注射过量的阻断剂AMD3100、RGD及AMD3100+RGD30min时，BXPC3肿瘤显影可被阻断。对照实验显示，MX-1细胞(P<0.001)对68Ga-yG5-RGD的摄取明显低于BXPC3。注射68Ga-yG5-RGD后，MX-1肿瘤始终未见显影。生物分布研究与显像结果一致。
结论：我们成功开发了能同时靶向CXCR4和整合素αvβ3的多肽异二聚体探针68Ga-yG5-RGD，其标记率及放化纯高，且表现出良好的体内外稳定性。该双受体靶向探针表现出更高的肿瘤摄取，更强的靶向能力及更长时间的肿瘤滞留，在肿瘤探测中显示出良好的应用前景。
目的：整合素αvβ3和氨肽酶N(aminopeptidase N, APN/CD13)是参与调节血管生成、肿瘤增殖、侵袭和转移的两个重要靶标。本研究中，我们设计并制备了一个多肽异二聚体探针68Ga-NGR-RGD，其由NGR(天冬-甘-精氨酸，Asp-Gly-Arg)和RGD(精-甘-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)多肽组成，分别靶向CD13和整合素ανβ3。将该异二聚体探针与相应的单靶向探针68Ga-NGR、68Ga-RGD进行比较，探索双受体靶向的异二聚体探针在乳腺癌显像中的可行性和优势。
方法：用双功能螯合剂NO2AtBu-N3修饰NGR多肽，通过无铜点击化学的方法偶联BCN-PEG4-c(RGDyK)。所得前体c(RGDyK)-PEG4-NOTA-click-PEG4-c(CNG RC)((简称为NGR-RGD)经纯化之后用68Ga标记。用放射分析型高效液相色谱(analyticalradio-highperformanceliquidchromatography,radio-HPLC)鉴定，并考察该探针的体内、外稳定性。用人乳腺癌细胞系MCF-7进行68Ga-NGR-RGD、68Ga-NGR和68Ga-RGD的体外细胞摄取及阻断实验。同时，用MCF-7皮下移植瘤模型鼠进行三种探针的小动物PET/CT显像及显像后的生物分布研究。选用4种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和MX-1进行68Ga-NGR-RGD的细胞摄取实验以及皮下移植瘤模型鼠显像和生物分布研究。制备乳腺癌肺转移模型，应用68Ga-NGR-RGD进行显像。分别通过蛋白免疫印迹分析和免疫组化染色鉴定细胞和肿瘤组织CD13、整合素ανβ3和CD31的表达。
结果：我们成功设计并制备了多肽异二聚体探针68Ga-NGR-RGD，其标记率及放化纯均大于99%(n=6)，比活度为45~100MBq/nmol(n=6)，体内、外稳定性好。MCF-7细胞相对高表达CD13和整合素αν，弱表达整合素β3；MDA-MB-231细胞高表达整合素αν，低表达整合素β3，不表达CD13；MDA-MB-468细胞弱表达CD13和整合素β3，高表达整合素αν；MX-1细胞不表达CD13、整合素αν和β3。细胞实验显示：MCF-7细胞对68Ga-NGR-RGD的摄取均明显高于单靶向探针68Ga-NGR(P<0.001)和68Ga-RGD(P<0.001)，且MCF-7细胞对68Ga-NGR-RGD的摄取均可被过量未标记的NGR-RGD、NGR+RGD、NGR及RGD阻断。2h时，68Ga-NGR-RGD在四种细胞中的摄取值MCF7>MDA-MB-231(P<0.01)>MDA-MB-468(P<0.001)>MX-1(P<0.001)。小动物PET/CT显像显示：注射68Ga-NGR-RGD30min后，MCF-7模型鼠肿瘤清晰可见。注射68Ga-RGD30min后，MCF-7肿瘤显影较双靶探针弱，而注射68Ga-NGR30min后，肿瘤隐约可见。当68Ga-NGR-RGD与阻断剂(RGD、NGR、NGR+RGD及NGR-RGD)共注射30min后，MCF-7肿瘤显影均不如未阻断清晰。体内生物分布研究结果与PET/CT显像结果一致。肿瘤组织CD13和整合素ανβ3免疫组化结果与细胞免疫印迹分析一致。68Ga-NGR-RGDPET/CT可以清晰显示MCF-7肺转移模型鼠的肺部转移病灶。
结论：我们成功设计并制备了双受体靶向探针68Ga-NGR-RGD，并显示该探针在乳腺癌动物模型中，相较于相应的单靶探针具有更高的肿瘤摄取、更高的靶向效率和更长的肿瘤滞留，并且可以清晰探测肺部转移病灶，具有良好的临床转化前景。
第二部分靶向CXCR4和整合素αⅴβ3的多肽异二聚体分子影像探针用于胰腺癌成像的实验研究
目的：CXC趋化因子受体4型(C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4)和整合素αvβ3在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中起重要作用，在人类多种癌症中过表达。与单靶同类探针相比，能够识别多个靶标的探针可以实现更高的靶向效率。本研究中，我们将CXCR4拮抗剂，小分子环肽cyclo(D-Tyr-N-Me-D-Lys-Arg-2-Nal-Gly)(简称为yG5)，FC131肽的类似物，与c(RGDyK)相连得到异二聚体cyclo(D-Tyr-N-Me-D-Lys-Arg-2-Nal-Gly)-NOTA-click-PEG4-c(RGDyK)((简称为NOTA-yG5-RGD)并用68Ga标记，制备双受体靶向探针68Ga-yG5-RGD用于胰腺癌显像研究，并与相应的单靶探针进行比较，以探索制备的双靶探针68Ga-yG5-RGD在胰腺癌探测中的可行性和优势。
方法：通过无铜点击化学的方法将yG5与RGD相连，经HPLC纯化后得到前体yG5-RGD并用高分辨质谱进行表征。用放射性核素68Ga标记，通过分析型radio-HPLC鉴定并考察其体内外稳定性。通过蛋白免疫印迹法和免疫组织化学染色分析分别表征人胰腺癌细胞BXPC3、人乳腺癌细胞MX-1及相应的肿瘤组织CXCR4和整合素αvβ3的相对表达水平。体外细胞实验和在体BXPC3、MX-1荷瘤鼠模型PET/CT显像及生物分布研究来评价68Ga-yG5-RGD在胰腺癌显像中的应用，并与相应的单靶探针进行比较研究。
结果：本研究成功构建了多肽异二聚体yG5-RGD，并用68Ga进行放射性标记，比活度为74~92MBq/nmol(n=6)，标记率及放化纯均大于99%。68Ga-yG5-RGD在PBS和新鲜人血清中于37℃孵育2h后，放化纯仍大于99%。将68Ga-yG5-RGD经尾静脉注入小鼠体内，2h后取尿液分析，探针未见明显脱标及降解。BXPC3相对高表达CXCR4和整合素αvβ3，而MX-1极低表达或不表达。体外细胞实验显示，BXPC3对68Ga-yG5-RGD的摄取显著高于对68Ga-yG5(P<0.001)和68Ga-RGD(P<0.001)的摄取，且能被过量的AMD3100(FDA批准的CXCR4拮抗剂)、RGD及AMD3100+RGD阻断。小动物PET/CT显像显示，68Ga-yG5-RGD主要经肝脏和肾脏代谢。在观察时间内，注射68Ga-yG5-RGD后，BXPC3肿瘤显影较注射68Ga-yG5和68Ga-RGD清晰。此外，注射68Ga-yG5-RGD2h时，BXPC3肿瘤仍清晰可见。阻断研究表明，共注射过量的阻断剂AMD3100、RGD及AMD3100+RGD30min时，BXPC3肿瘤显影可被阻断。对照实验显示，MX-1细胞(P<0.001)对68Ga-yG5-RGD的摄取明显低于BXPC3。注射68Ga-yG5-RGD后，MX-1肿瘤始终未见显影。生物分布研究与显像结果一致。
结论：我们成功开发了能同时靶向CXCR4和整合素αvβ3的多肽异二聚体探针68Ga-yG5-RGD，其标记率及放化纯高，且表现出良好的体内外稳定性。该双受体靶向探针表现出更高的肿瘤摄取，更强的靶向能力及更长时间的肿瘤滞留，在肿瘤探测中显示出良好的应用前景。