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目的： 核酸适配体（Aptamer）是可以特异性识别特定靶标的单链寡核苷酸序列，可通过指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选程序从核酸文库中获得。同抗体相比核酸适配体具有无免疫原性、易获得、可体外合成以及成本低等优点。因此核酸适配体常用于肿瘤标记物筛选以及肿瘤的靶向治疗。B7-H4分子在一些肿瘤组织中表达增高，对于相关肿瘤的早期诊断具有重要意义。本研究通过慢病毒转染293T细胞，构建稳定表达B7-H4蛋白的293T细胞系，以其作为B7-H4核酸适配体筛选的靶细胞，利用CELL-SELEX技术筛选B7-H4特异性核酸适配体，为B7-H4高表达肿瘤的诊断试剂的研制提供研究材料。 方法： 1.表达B7-H4蛋白的稳定转染细胞株的构建 通过慢病毒转染293T细胞，构建稳定表达 B7-H4蛋白的细胞系。采用流式细胞术以及Western blot验证细胞中B7-H4蛋白的表达。 2. CELL-SELEX技术筛选B7-H4特异性核酸适配体 合成随机核酸文库以及通用的引物，使用稳定表达B7-H4的细胞系和对照293T细胞进行CELL-SELEX正反筛选，利用PCR扩增筛选后的次级核酸文库并进行ssDNA回收，重复筛选以富集特异性识别靶标的核酸序列。利用流式细胞术检测次级核酸文库的富集情况。 3. B7-H4特异性核酸适配体的鉴定 待核酸文库富集情况达到稳定，将次级核酸文库扩增回收后克隆到pMD18-T Vector上并交给测序公司进行初步测序。为了对次级文库进行批量分析，对次级核酸文库进行高通量测序，通过对测序结果进行进化树分类以及二级结构预测来筛选序列。合成筛选序列，通过流式细胞术对序列的结合能力以及特异性进行验证。 结果： 1.慢病毒转染293T细胞后，通过嘌呤霉素（2.5μg/mL）进行抗性筛选以及流式细胞术分选，成功获得稳定表达B7-H4蛋白的293T细胞系。 2.经过10轮的细胞筛选，流式细胞术可以检测到次级核酸文库和B7-H4-293T细胞的结合率随着筛选次数的增加而有所提高，随着筛选次数的增加，次级核酸文库与对照293T细胞的结合率变化不明显，由此说明经过CELL-SELEX筛选的能够结合B7-H4的特异性核酸适配体有所富集。 3.通过高通量测序确定次级核酸文库中识别结合B7-H4的ssDNA碱基序列，流式细胞术验证表明所合成的序列Seq3、Seq5能够结合B7-H4-293T细胞，但是其与对照细胞也有一定的结合。 结论： 1.成功构建了稳定表达B7-H4蛋白的293T细胞系。 2.建立了通过CELL-SELEX筛选B7-H4分子的靶标细胞的筛选方法，并获得了结合B7-H4的次级核酸文库。 3.筛选得到的Seq3、Seq5ssDNA序列可以结合B7-H4-293T细胞，但识别能力欠佳。