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鹿茸是迄今为止发现的唯一能够周期性再生的哺乳动物器官,它的生长速度极快却没有发生癌变。鹿茸再生的生物学研究对人类器官再生和肿瘤预防治疗有重要意义。鹿茸再生是由角柄骨膜细胞驱动的,角柄骨膜细胞是一种鹿茸再生干细胞。角柄骨膜包括致敏区和休眠区。正常生理条件下,角柄致敏区骨膜(Potentiated pedicle periosteum,PPP)能够发育成完整的鹿茸组织,而角柄休眠区骨膜(Dormant pedicle periosteum,DPP)则不能。因此,DPP和PPP的组织功能差异研究是揭开鹿茸再生之谜的重要途径。细胞膜是保证细胞内各生理活动正常运行的重要屏障,具有免疫应答、粘附迁移、细胞识别以及信号转导等重要功能。对鹿茸再生干细胞膜蛋白质组学进行深入系统研究,必将为揭示鹿茸再生之谜提供有益线索。为了研究DPP和PPP细胞差异表达膜蛋白,利用2D DIGE技术展开了以下试验:(1)用不同细胞获取方法和纯化方式进行鹿茸再生干细胞膜蛋白的制备,对不同组合方法进行浓度测定和SDS-PAGE电泳并进行结果分析;(2)进行丙酮纯化、2D Clean up kit纯化和不纯化三种方式的膜蛋白双向电泳,对比试验结果;(3)进行梅花鹿DPP和PPP进行细胞培养和膜蛋白提取,2D DIGE试验和质谱鉴定;(4)对差异表达膜蛋白进行生物信息学分析,对6个鉴定的差异表达膜蛋白进行了qRT-PCR验证。结果显示:(1)细胞刮法获取鹿茸再生干细胞优于胰酶消化法,2D Clean up kit纯化处理的膜蛋白双向电泳图最优,丙酮次之,不纯化效果最差;(2)细胞刮取结合2D Clean up kit纯化处理进行鹿茸再生干细胞膜蛋白双向电泳获得了理想的图谱;(3)通过鹿茸再生干细胞膜蛋白的2D DIGE分析,具有统计学意义(p<0.05,差异倍比≥1.2)的差异蛋白质点122个,最终鉴定出53个可用的膜蛋白。其中有17个膜蛋白在PPP细胞中上调表达,36个膜蛋白在PPP细胞中下调表达;(4)验证结果显示,HSPB1、FTL、SEPT11、VCL、RUVBL2和PHGDH的qRT–PCR结果与2D DIGE结果相一致,证明实验结果准确可靠。得出以下结论:(1)获得了优良的鹿茸再生干细胞膜蛋白组表达图谱,包含3398个蛋白点;(2)具有统计学意义(p<0.05,差异倍比≥1.2)的差异蛋白质点122个,最终鉴定出53个可用的膜蛋白,按功能分类主要有催化活性、结合、结构分子、载体转运和酶调节等;(3)与DPP相比,在PPP细胞中有17个膜蛋白上调表达,可能参与了由休眠干细胞向致敏干细胞的转变,是参与鹿茸再生的候选蛋白;(4)推测Vinculin、ANXA5、ANXA2和HSPB1等蛋白与鹿茸再生过程密切相关,Vinculin为重点蛋白,可能通过细胞迁移和细胞稳定性来调控鹿茸生长;HSPB1和一些抗氧化蛋白可能共同组成了一套完善的氧化还原平衡系统,防止由于DNA损伤而造成鹿茸干细胞转化成肿瘤细胞,保证鹿茸组织快速生长发育而未发生癌变。