禽流感(Avian influenza,AI)是由甲型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病,极大地危害人类健康和畜牧业生产,并严重影响国家的经济发展。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)基因组极易发生变异,造成病毒的多型性,给禽流感防治带来很大难度。目前,还不清楚哪些特异突变可以使H5N1病毒能稳定地在人-人之间传播,但是一旦发生H5N1病毒突变导致对人的特异性,将会给人类造成重大灾难。人们对于禽流感的预防与治疗主要集中在疫苗和抗病毒药物两种方法上,而疫苗从注射到产生保护性抗体需要较长时间。由于禽流感病毒对离子通道抑制剂、神经氨酸酶抑制剂等化学药物容易产生抗性,这将都会影响疾病的控制效果。近两年来有关禽流感被动免疫预防和治疗的研究是禽流感研究的热点之一。使用抗体制剂对禽流感进行被动免疫预防和治疗,可以在使用之后立刻产生防护效果,从而可以弥补疫苗和化学药物的不足。禽流感是一种呼吸道传染病,感染途径主要是呼吸道和消化道。分泌型IgA(Secretory IgA,SIgA)抗体在这里具有重要作用,作为一种被动免疫制剂,在病毒感染发生的早期阶段给药,可有效地抵抗病毒的感染。另外,由于通过滴鼻/喷雾或口服/灌胃即可给药,这种非系统的、局部的用药方式不仅方便、安全,而且成本较低。因此,研究呼吸道或消化道分泌型IgA对禽流感病感染的阻断作用,具有潜在的应用价值。分泌型IgA抗体在结构和功能上还具有独特的特点,与普通的IgG和IgA抗体分子相比,SIgA抗体有许多优良的特性。SIgA由2个IgA构成,故其与抗原的结合价比较高,具有较高的抗体活性。由于分泌片的存在,使SIgA可以抵抗酸和蛋白酶的降解,提高了SIgA的稳定性,有研究表明,SIgA分子可以在人体外分泌道存在四个月以上。此外,分泌片具有非特异性的病原体结合活性,从而使SIgA具有非特异的免疫保护作用;分泌片使SIgA整齐规则地排列在粘膜表面形成隔离保护层,可对病原微生物的入侵产生物理防护作用。本研究利用基因工程手段,通过稳定转染CHO/dhfr-细胞系,构建了稳定表达分泌型IgA的单克隆细胞系,具体研究内容和结果如下:1分泌片SC和IgJ基因真核表达质粒的构建分泌型IgA相关基因(SC、IgJ基因、人IgA重链恒定区、人Kappa链恒定区)的克隆、抗H5N1单克隆抗体可变区基因(重链、轻链可变区)以及轻重链真核表达质粒的构建已由本实验室在前期工作中完成。基于优化的实验方案,我们又将SC、IgJ基因克隆到了含有Zeocin抗性基因的真核表达载体pcDNA4/HisA中,构建了SC和J链的真核表达载体pCDNA4-IgJ、pCDNA4-SC。2抗H5N1-HA嵌合SIgA抗体在CHO细胞中的表达及免疫学特性分析将抗H5N1抗体轻、重链真核表达质粒转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌表达抗H5N1病毒的IgA抗体的单克隆细胞系,制备嵌合IgA单体抗体,并对其免疫学特性进行分析;然后在稳定表达IgA单体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系的基础上,共转染SC和J链真核表达质粒,利用Zeocin抗生素筛选分泌SIgA的单克隆细胞,通过ELISA和Western blotting分析了细胞培养上清中SIgA的表达情况,并证明表达的SIgA抗体具有完整的十聚体结构,而且ELISA实验也表明SIgA抗体与H5N1 HA抗原具有很好的结合能力。3提高SIgA抗体表达量的相关研究氨甲喋呤(MTX)是二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制物,当培养基中存在MTX时,MTX可渗入细胞内与DHFR蛋白结合,使核苷酸的合成受阻,只有DHFR基因得到扩增的克隆才能存活。DHFR基因的扩增使其附近的DNA得到扩增,从而提高与之毗连的外源基因的表达水平。MTX加压程序是,先将待加压的细胞株传入细胞培养瓶中,将培养液换成含5nM MTX的加压培养基。当培养的细胞长到汇合度90%时,以1:4传代,连续传五代,然后换成25nM的MTX加压培养基,以此类推,最终加压浓度为125nM。MTX加压程过程中采用96孔板倍比稀释的方法筛选加压后的SIgA单克隆细胞系,获得表达量较高的细胞株。4分泌型IgA的发酵培养及纯化将SIgA单克隆细胞无血清培养驯化2个月,采用CD CHO培养基(含一定浓度的MTX),逐渐降低DMEM和透析血清浓度,直至其完全适应CD CHO生长;悬浮培养2-4周,培养基仍为CD CHO(含加压浓度的MTX)。收集细胞培养上清1L左右利用Protein-L的亲和层析柱进行纯化。5分泌片SC单克隆抗体的制备在SIgA抗体检测过程中,需要大量SC单抗,我们首先构建了原核表达载体pQE80L-SC,然后进行SC蛋白的诱导表达,SC蛋白经过纯化回收免疫小鼠,制备了2株单克隆抗体,并利用这些抗体建立了SIgA的快速诊断检测方法。