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乳汁是哺乳动物新生儿最重要的营养和被动免疫来源,富含多种免疫成分,能够满足婴幼儿大脑发育、生长以及健康免疫系统的各种需求。动物体液中的microRNA (miRNA)通常被选择性地包裹在exosome中。Exosome是由很多种类的细胞所分泌的一种带膜囊泡,这些exosome中的miRNAs能够被主动地定向输送到受体细胞,并调节靶基因的表达和受体细胞的功能。本研究中,利用原子力显微镜(Atomic force microscope, AFM)证实猪乳汁中大量存在exosome的基础上,构建了约克夏猪整个泌乳期内(从初生到28日龄)6个不同泌乳阶段(出生后0、3、7、14、21和28d)乳汁exosome small RNA文库,以出生后0d和3d的乳汁作为初乳,其他日龄的乳汁作为常乳进行对比性分析,用高通量测序的方法分析和注解了初乳(0d和3d)和常乳(7、14、21和28d)exosome中的miRNA表达谱,筛选与免疫密切相关的miRNA,分析其在不同环境下的耐受(稳定)性；对免疫相关的miRNA在仅初乳和仅常乳喂养的仔猪体内的差异表达进行研究，通过仔猪活体模型研究以评估其在仔猪生长发育及免疫系统形成过程中的功能。结果表明：以超高速离心的方法从猪乳汁中分离到含量较丰富的exosome。通过AFM在纳米水平观察到猪乳汁中exosome平均宽度约100nm,高度约12nm。Small RNA文库中没有检测到18S和28S核糖体RNA,但大量存在长度小于300nt的small RNAso Illumina Genome Analyzer Ⅱ(GA Ⅱ)高通量测序结果表明,猪乳汁exosome中存在丰富的miRNAs,绝大部分(91.97±3.18%)可“定位”(即可map到猪基因组序列中)的读数长度在21-24nt之间,其中,长度为22nt的读数达到(67.93±4.81)%。长度为23nt的读数占(15.92±2.27)%,24nt占(4.71±1.65)%,21nt占(3.42±1.77)%。这些读数的长度都是典型的Dicer酶加工产物的长度,符合miRNA的基本结构特征。高通量测序数据的生物信息学分析表明,在8个猪乳汁exosome small RNA文库中共检测到180种pre-miRNAs。其中,140种(77.78%)是已知的猪pre-miRNAs,另外40种(22.22%)是新发现的猪pre-miRNAs。新发现的40种猪pre-miRNAs全部与miRBase18.0中已报道的人pre-miRNAs具有同源性,并能够被定位到猪基因组上。这180种pre-miRNAs共可编码237种成熟miRNAs,对应234种特异性]niRNAs。基于Pathway Central Database (SABiosciences, MD, USA)的注解,在niRBase(Version18.0)数据库中注册的1527种已知人的pre-miRNAs中,存在84种(5.50%)与淋巴细胞和其他免疫细胞功能相关的免疫性pre-miRNAs。以此为基础的比对结果表明,本研究的8个猪乳汁exosomesmall RNA文库中,共检测到58种(69.05%)存在并富集于各阶段猪乳汁exosome的miRNA文库中(P＜10-16,χ2test)。并且,各个泌乳阶段与免疫相关的pre-miRNAs在总乳汁exosome miRNA文库中的比例都超过了30%,极显著地高于人miRNA文库中免疫性相关pre-miRNAs5.50%的比例。此外,在出生后前3天的初乳中,与免疫相关的pre-miRNAs均达到52种以上,显著地高于常乳(P<0.05)。进入常乳期后,则降低到40种左右,这暗示着乳汁在仔猪免疫系统功能中发挥着重要功能。在乳汁exosome的miRNA转录本中,绝大多数miRNAs转录子来自于很少几种miRNAs。在234种特异性miRNAs中,以reads数计算,表达水平最高的前10种miRNAs的含量超过总量的87.25%。6个泌乳阶段里表达水平最高的前10种高丰度miRNAs一共包括有13种特异性miRNAs。其中有7种miRNAs (miR-148a-3p, miR-182-5p, miR-200c-3p, miR-25-3p, miR-30a-5p, miR-30d-5p和miR-574-3p)在6个泌乳阶段miRNA文库里的表达量都排在前10位,它们在不同的免疫和病理状态下承担着重要的功能。另外6种miRNAs(let-7a-1-5p, miR-30c-2-5p and-1-5p, miR-191-5p, miR-375-3p, miR-21-5p和miR-27b-3p)至少在某一个泌乳阶段的miRNA文库里的表达量位于前10位,它们也无一例外地都和不同的免疫与病理学反应相关。猪乳汁exosome中miRNA的表达谱呈现典型的泌乳特异性模式,初乳和常乳间存在明显差异,表现为免疫相关miRNA在初乳中的含量显著高于常乳。定量分析结果表明,13种在6个泌乳阶段里表达量最高的与免疫相关的高丰度miRNAs中,除miR-148a-3p外,其它12种特异性miRNAs在初乳中的表达量都高于常乳,而在6个阶段里所有高丰度miRNAs中表达水平都为最高的niR-148a-3p的表达量则是随着泌乳期而增加。这些免疫相关的miRNAs都会功能性地靶向编码细胞活素和其它免疫调节蛋白,以及免疫反应信号通路上的其它组分等特异性转录本而行使其免疫调控功能。与外源添加的秀丽隐杆线虫(C. elegans)特异性miRNAs (cel-lin-4-5p, cel-miR-2-3p和cel-miR-39-5p)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)特异性miRNA (ath-miR-159a-3p)相比,5种内源性乳汁exosome来源的高表达：niRNAs (miR-148a-3p, miR-30c-5p, miR-574-3p, miR-21-5p和miR-27b-3p)对不同的极端理化条件(低温、高温、低pH、反复冻融、外源RNA酶等)都表现出较强的抗降解能力,说明乳汁exosome中的miRNAs是以一种非常稳定的状态存在,可以保护其在不同极端条件下免受内源性RNA酶的降解。不同乳汁饲喂实验表明,仅初乳和仅常乳喂养的仔猪,其血清中的7种代表性血液循环代谢生化指示物的含量在两组仔猪血清中相近,没有发生显著性变化(P>0.05)。但13种特异性免疫相关的高丰度miRNAs在不同饲喂组间的血清表达量呈现出明显的差异。表现为：在只喂初乳的仔猪中,除了miR-148a-3p外的其它12种miRNAs的血清表达量都显著地高于只饲喂常乳的仔猪。而miR-148a-3p的表达量在饲喂常乳组仔猪血清中的表达量则显著地高于饲喂初乳组(P<0.05)。仔猪血清中各免疫相关高丰度miRNAs的总体表达趋势与之前乳汁实验中关于初乳和常乳中13种免疫相关高丰度miRNAs的表达规律一致。这些猪乳exosome中与免疫相关的miRNA可能是通过消化道而直接进入仔猪的体内发挥其调控功能,从而潜在影响着仔猪免疫系统的发育。上述研究结果为深入研究乳汁在婴儿免疫系统发育过程中的重要功能提供了动物模型基础数据,证明猪是人类泌乳医学和免疫疾病研究理想的模式生物。