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目的： 本实验以人卵巢癌SKOV3细胞株及其移植瘤裸鼠为研究对象，观察ZMYL对顺铂治疗人卵巢癌SKOV3移植瘤裸鼠的增效作用，并从STAT3信号通路及其下游基因的增益变化探讨其作用机制，观察ZMYL降低对顺铂损伤裸鼠卵巢的毒性反应，表明ZMYL具有保护卵巢功能及调节外周激素水平的作用，探索将ZMYL内主要中药单体芍药苷联合熊果酸在不同药物浓度组合下对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响，以验证中药单体联合具有协同相须的作用。 方法： 1.ZMYL对顺铂治疗人卵巢癌细胞SKOV3移植瘤裸鼠的增效作用 雌性BALB/C裸鼠皮下接种人卵巢癌细胞SKOV3细胞株，构建SKOV3卵巢癌荷瘤小鼠模型，随机分4组:对照组（灌胃生理盐水）、中药组（灌胃中药悬液）、化疗组（腹腔注射化疗液，灌胃生理盐水）、化疗+中药联合组（腹腔注射化疗液，灌胃中药悬液），每组9只。同条件饲养正常组小鼠9只。造模裸鼠腹腔注射顺铂剂量为3.0 mg×kg-1，灌胃中药药液剂量为1 g×kg-1。顺铂每3d给药1次，中药每天给药1次，各组连续给药3周观察裸鼠一般情况及移植瘤生长情况（包括体重、肤色、饮食、二便、移植瘤体积变化），3周后处死取材，取移植瘤组织，称重并计算抑瘤率。HE染色后观察移植瘤组织形态学变化，采用ELISA试剂盒检测瘤体内Her2的水平，RT-PCR检测瘤体内HER2及Survivin基因mRNA的表达，Western Blot技术观察移植瘤内Jak-Stat信号通路相关的STAT3、P-STAT3的蛋白表达及其相关下游靶基因CyclinD1及Caspase-3蛋白的表达。 2.ZMYL降低顺铂损伤小鼠卵巢药物毒性的实验研究 构建SKOV3卵巢癌荷瘤小鼠模型4组，每组9只，分组用药方法同前，同条件饲养正常组小鼠9只。各组连续给药3周后处死取材，取小鼠卵巢及外周血，将小鼠卵巢称重，HE染色后观察小鼠卵巢内卵泡形态及类别，利用TUNEL法检测卵巢细胞的凋亡，采用ELISA试剂盒测量小鼠外周血血清雌二醇(E2)、促卵泡成熟激素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)的数值。 3.ZMYL内有效单体联合对卵巢癌细胞增值的抑制作用 查找以往文献，将ZMLY的药效学研究发现的中药活性物质含量最高的芍药苷单体选入测试用药。 (1)选取ZMYL中半枝莲含有的6个中药单体通过MTT法检测梯次浓度对SKOV3贴壁细胞增殖的影响，筛选出最有效单体熊果酸;(2)用MTT法检测梯次浓度3.125-100ug/L的芍药苷组、熊果酸组、芍药苷联合熊果酸组对SKOV3贴壁细胞增殖抑制作用。梯次浓度检测200-6400ug/L芍药苷组、200-6400ug/L芍药苷联合3.125-100ug/L梯次浓度下熊果酸组对SKOV3贴壁细胞的增殖抑制作用，(3)分别以200ug/L、400ug/L、800ug/L固定的芍药苷浓度联合3.125-100ug/L梯次浓度下熊果酸组，检测对SKOV3贴壁细胞的增殖抑制作用。观察和比较不同药物浓度组合下对细胞增殖抑制率、IC50的变化及影响。 结果： 1.ZMYL对顺铂治疗人卵巢癌细胞SKOV3移植瘤裸鼠的增效作用 (1)比较小鼠前后体重变化:荷瘤模型小鼠体重均同正常小鼠有明显差异(P＜0.01)，各造模组之间差异不明显;比较各组小鼠移植瘤体积和重量:化疗组及化疗+中药组移植瘤组织重量均显著小于对照组(P＜0.05)，其余组间均无明显差异;比较各组抑瘤率:中药组56％，化疗组72.15％，化疗+中药组81.82％，均为有效抑瘤效果;观察瘤体HE染色后光镜观察结果显示:对照组移植瘤细胞恶性程度高，排列紊乱，可见大量的坏死组织;化疗组及化疗+中药组肿瘤分化程度明显好于对照组。 (2)比较各组治疗后瘤体Her2水平的表达:ELISA试剂盒显示化疗组、化疗+中药组均同对照组差异显著(p＜0.05);化疗组同中药组无差异(P＞0.05).;RT-PCR比较各组瘤体内HER2及Survinvin mRNA的表达:检测显示同对照组相比，化疗组、化疗+中药组均低于对照组且差异显著，化疗+中药组明显优于化疗组(p＜0.05)，HER2 mRNA的表达显示化疗组、化疗+中药组均同对照组差异显著(p＜0.05);化疗组同中药组无差异(P＞0.05)。比较各组瘤体内STAT3基因蛋白的及其下游靶基因蛋白的表达:用Western-blot检测显示各组STAT3蛋白表达无异常，化疗组及化疗+中药组P-STAT3蛋白表达水平受到明显抑制，Cycling D1表达水平同时下调，Caspase-3表达水平明显上调。 2.ZMYL降低顺铂损伤小鼠卵巢药物毒性的实验研究 (1)比较各组小鼠卵巢形态学变化:各组荷瘤小鼠卵巢重量同正常小鼠比较均有明显差异(P＜0.01)，各组间比较化疗+中药组同对照组无差异，其余各组均有差异(P＜0.05)，化疗组卵巢重量最低;观察卵巢HE染色后光镜观察结果显示:正常组的裸鼠卵巢光镜下可见清楚的结构，卵巢皮质和髓质结区分明显，卵泡发育良好，对照组裸鼠的卵巢光镜下看见部分闭锁卵泡，中药组小鼠卵巢光镜下皮质内分别看见一些初级和次级卵泡。化疗组光镜下卵巢内大批卵泡萎缩，偶有部分原始卵泡，可以看见间质及炎症细胞增生明显，化疗+中药组的小鼠卵巢皮质中同时存在闭锁卵泡及发育卵泡;比较各组TUNEL法检测卵巢细胞凋亡结果表明:同正常组比较，对照组、化疗组、中药组、化疗+中药组凋亡指数均明显大于正常组，差异显著(P＜0.05)。同化疗组比较，对照组、化疗组、中药组、化疗+中药组卵巢细胞凋亡指数均显著小于化疗组，差异显著(P＜0.01)。中药组凋亡指数明显小于对照组，差异显著(P＜0.05)，对照组同化疗+中药组卵巢凋亡指数无显著性差异(P＞0.05)。 (2)比较小鼠干预后外周血E2、FSH、AMH数值变化:各组小鼠外周血血清雌二醇(E2)数值均明显小于正常小鼠，差异显著具有统计学意义(P＜0.05)。各组间比较化疗组明显低于其他各组，差异显著(P＜0.05)，其余各组无显著差异。血清促卵泡生成素(FSH)值各组除化疗+中药组外均大于正常组，并且差异显著(P＜0.05)，组间比较除对照组外均小于化疗组，差异显著(P＜0.05)，化疗+中药组同对照组也差异明显(P＜0.05)，其余各组无明显差异。抗苗勒管激素(AMH)各组小鼠均有明显差异(P＜0.05)。AMH浓度从高到低分别为正常组15.32±0.865＞中药组11.78±1.634＞中药+化疗组10.31±1.363＞对照组8.41±1.456＞化疗组5.85.41±1.55(pg/ml)。 3.芍药苷联合熊果酸单体组合对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响 (1)梯次浓度的6个单体汉黄芩素、黄芩素、熊果酸、齐墩果酸、木犀草素、芹菜素对SKOV3细胞的增殖抑制率较阴性对照组均有显著增高(P＜0.01)，其中熊果酸IC50值最低;3.125-100mg/L浓度的熊果酸对卵巢癌干细胞的增殖抑制率较阴性组均有显著增高(P＜0.01)，IC50最低为11.38mg/L;12.5mg/L浓度的抑制率达53.61％。由此确定熊果酸及以往文献研究结果选定的的芍药苷作为下一步联合单体选用药物。 (2)3.125-100mg/L梯次浓度芍药苷、熊果酸、芍药苷联合熊果酸对SKOV3细胞的增殖抑制率显示:芍药苷在常规浓度条件下对SKOV3细胞抑制作用不明显100mg/L抑制率仅为24.48％，熊果酸抑制作用稳定，芍药苷联合熊果酸抑制作用同熊果酸单药作用相比无明显差异。200-6400mg/L梯次浓度下芍药苷、芍药苷联合3.125-100mg/L的熊果酸对SKOV3细胞的增殖抑制率显示:芍药苷在1600mg/L以上对细胞的抑制率才明显上升，联合药物组当芍药苷400mg/L+熊果酸6.25mg/L，抑制率明显上升达64.76％。熊果酸IC50下降至5.68mg/L，芍熊联合后熊果酸抑瘤效果明显增强。 结论： 1.ZMYL对顺铂治疗人卵巢癌细胞SKOV3移植瘤裸鼠具有促进瘤体的缩小、提高药物治疗的抑瘤率。改善肿瘤细胞的分化和增殖。 2.ZMYL联合顺铂能降低瘤体内原癌基因Her-2以及凋亡抑制因子survinvin基因的表达，从而减弱了肿瘤抗凋亡能力，有效抑制肿瘤的生长。 3.ZMYL对顺铂治疗的增效作用机制可能同降低JAK-STAT信号通路中P-STAT3的表达水平，抑制STAT3的激活，进而下调细胞周期基因CyclinD1蛋白表达，上调促凋亡基因Caspase3蛋白的表达，促进肿瘤细胞的凋亡相关。 4.ZMYL可以通过增加卵巢重量，减少卵泡细胞凋亡，有效调节外周血E2、FSH、AMH等激素水平，从而达到减少化疗药物对于卵巢的毒副作用 5.中药配方中含有的有机酸类中药单体熊果酸具有较强抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用;芍药苷常规单独应用对卵巢癌SKOV3细胞抑制增殖作用不强，大剂量芍药苷可明显提高抑制率。 6.芍药苷联合熊果酸可有效增强同等浓度下熊果酸对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用，降低熊果酸的IC50的药物浓度，单体联合最佳有效药物浓度比例为80∶1。