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雷帕霉素机能靶蛋白复合物1(mTORC1)是调控细胞生长、代谢以及衰老等过程的一种关键因子。当前的研究发现,溶酶体是激活mTORC1的一个重要细胞内场所。当溶酶体内有高浓度氨基酸(尤其是亮氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)时,mTORC1从细胞质转移到溶酶体表面,随后被溶酶体表面的小GTP酶Rheb激活。根据这一模型,溶酶体内的氨基酸是激活mTORC1的关键信号分子。然而关于溶酶体内氨基酸的调控机制目前尚缺乏研究。PAT1(Proton-coupledAmino acidTransporter1)是一种在机体内广泛分布的质子偶联氨基酸转运蛋白。在大多数细胞中,PAT1主要定位在溶酶体膜,将质子和氨基酸由溶酶体向细胞质运输。人们已经发现PAT1调控mTORC1,但对于其作用机理尚存争议。本项研究以人源HEK 293细胞为主要细胞模型,围绕PAT1调控mTORC1的机理,重点调查了PAT1的细胞内定位及其转运功能在调控mTORC1中的作用,主要试验内容与发现如下: (1)制备了高表达myc-PAT1的HEK 293稳定细胞系。在正常培养条件下,高表达myc-PAT1对于mTORC1活性无显著影响。通过饥饿同步化处理细胞以后,给予细胞短时间的氨基酸刺激(10分钟)导致mTORC1活性在myc-PAT1细胞中降低;而长时间氨基酸刺激(大于20分钟)后,mTORC1活性在myc-PAT1和HEK 293对照细胞中无显著差异。这些结果表明PAT1对mTORC1的调控效果受到氨基酸信号的影响。 (2)PAT1蛋白分子内部的两个半胱氨酸残基(C180、C329)之间形成一个二硫键,该二硫键对于结合氨基酸分子具有重要作用。为了研究PAT1氨基酸转运功能对于调控mTORC1的意义,制备了两种PAT1突变体的稳定表达细胞系,包括单突变C180A(sM),以及双突变C180/329/A(dM)。结果显示,这两种PAT1突变蛋白可以正确定位在溶酶体。然而与野生型PAT1相比,过表达这两种氨基酸结合突变的PAT1不能抑制mTORC1。 (3)PAT1是一种质子协同的氨基酸转运蛋白,PAT1与质子的结合对于其运输功能具有重要作用。我们制备了PAT1质子运输突变的稳定表达细胞系—H55A。该突变蛋白可以正确定位在溶酶体,但过表达该突变体不能抑制mTORC1的活性。 (4)色氨酸及其衍生物5-羟色胺是PAT1运输氨基酸的竞争性拮抗物。在培养基中添加色氨酸或者5羟色胺可以拮抗过表达PAT1抑制mTORC1的效果。 (5)利用CRISPR/Cas9系统,在HEK 293T细胞上制备了PAT1敲除细胞系(PAT1-/-)。在正常培养条件下,与对照组细胞(HEK 293T)相比,PAT1-/-细胞中mTORC1活性无显著变化。在氨基酸缺乏的情况下,随着饥饿时间的延长,PAT1-/-细胞中mTORC1活性不断降低,但降低的速度慢于对照组;反之,在过表达myc-PAT1细胞中,mTORC1活性的下降速度快于对照组。这些结果说明PAT1的表达量影响PAT1调控mTORC1的效果。 根据以上结果,本研究得到两项重要发现:PAT1调控mTORC1受氨基酸信号的影响;PAT1的氨基酸转运功能对于其调控mTORC1具有重要作用。这些发现支持目前的一个模型,即氨基酸可以通过影响PAT1的细胞内定位调控溶酶体内的氨基酸水平,从而调控mTORC1的活性。