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细胞是生物体结构和功能的基本单位,利用活细胞作为研究对象,在单分子水平上研究生命的基本过程,了解生命现象的本质,具有极其重要的意义。近年来这方面的科学研究方兴未艾,成为生物物理和生物化学的前沿领域,而这一领域的研究也具有很大的挑战性。单分子荧光技术的发展和应用为活细胞的实时研究提供了新的手段,利用全内反射荧光显微镜可以实现高时空分辨率的单分子成像,尤其适合细胞膜表面生命过程的研究,目前已经成为探究膜表面生物分子相互作用机理等问题的有利工具。
转化生长因子TGF-β信号转导体系是一类重要的细胞信号转导体系,在调控细胞的增殖、分化、凋亡等许多方面起重要的作用。目前关于这一体系的研究结论大多都是由离体生化实验为基础得到的,信号通路细节并不清楚或存在争议,因此在活细胞中研究TGF-β信号转导显得尤为重要。
本论文利用全内反射荧光显微术,围绕单分子水平实时研究TGF-β信号转导过程中,TGF-β受体在细胞膜表面的寡聚化和相互作用展开工作,主要内容有:
1.发展了细胞外绿色荧光蛋白单分子成像的方法。利用不同固定方法获得单分散的GFP,为进一步实现活细胞GFP单分子荧光成像打下了基础。
2.实现了活细胞膜表面GFP偶联TβRⅠ型和TβRⅡ型受体的单分子成像,并根据荧光强度分析了受体在活细胞中的存在状态,结果表明受体在外加配体TGF-β1刺激的条件下发生同聚和异聚;发现在低表达量下受体可能以单体的形式二聚化这一与已有生物学实验结论不同的新结果。
3.建立了单粒子追踪运动(SPT)分析方法。分析了TβRⅠ-GFP(RFP)和TβRⅡ-GFP(RFP)在膜表面的运动类型,首次得到了TGF-β受体在活细胞表面的单分子侧向扩散速度;研究了细胞膜微环境对TGF-β受体运动和相互作用的影响,提出脂筏微区的存在有利于受体异聚的新观点,这一结果有利于深入了解膜微环境对TGF-β信号转导的影响。
4.实时原位观察了TGF-β受体在活细胞表面的同聚和异聚过程,发现受体大多通过定向运动相互靠近、结合以实现受体的同聚和异聚。