论文部分内容阅读
目的:IL-17是一种主要由活化的人记忆CD4+T细胞分泌的促炎细胞因子,在固有免疫和适应性免疫中发挥作用,参与细胞的增殖分化、生物因子的转录与表达、机体的免疫调节及肿瘤生长。本研究采用IL-17真核表达载体pcDNA3.1-IL-17转染小鼠胃癌细胞株MFC,过表达IL-17,观察IL-17过表达后对MFC细胞体外生长及其它生物学性状的影响,进一步通过建立荷瘤小鼠动物模型观察IL-17过表达后MFC细胞在小鼠体内的成瘤效应,并分析其分子改变,以期探讨Th17/IL-17在胃癌发生发展中的作用机制。方法:1将IL-17真核表达载体pcDNA3.1-IL-17转染小鼠胃癌细胞株MFC,同时将pcDNA3.1空载体转染MFC细胞作为对照组细胞,经G418筛选后获得稳定表达IL-17的阳性细胞克隆(MFC/IL-17)。2倒置显微镜下观察MFC、MFC/pcDNA3.1及MFC/IL-17细胞的形态变化,RT-PCR检测IL-17基因表达,ELISA法检测细胞分泌IL-17的能力。3MTT法测定转染前后细胞的体外增殖反应并绘制生长曲线。流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化。4RT-PCR法检测转染前后细胞内趋化因子CCR6、CCL20、CXCL2和免疫调节因子VEGF、MMP-9、IL-6的表达变化。5分别以MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17细胞接种615小鼠,建立荷瘤小鼠动物模型,观察小鼠成瘤及皮下肿瘤生长情况。6接种肿瘤细胞3周后处死小鼠,RT-PCR法检测肿瘤组织内IL-17、VEGF和Podoplanin mRNA表达。Western-blot法检测肿瘤组织内IL-17、VEGF和Podoplanin的蛋白表达。免疫组化法检测肿瘤组织内微血管的形成情况。结果:1将IL-17基因转染小鼠胃癌MFC细胞,建立MFC/IL-17细胞株。光学显微镜下观察MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17细胞无明显形态学变化;RT-PCR实验结果显示,MFC/IL-17细胞能表达IL-17基因,而MFC和MFC/pcDNA3.1细胞无IL-17基因表达。ELISA实验结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1细胞相比,MFC/IL-17细胞分泌IL-17能力明显增强(P<0.05)。2MTT实验结果显示,MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17细胞的体外增殖活性无明显差异(P>0.05)。流式细胞分析结果显示,三组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)。上述结果提示,转染IL-17基因对MFC细胞的体外增殖和凋亡无显著影响。3RT-PCR实验结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1细胞相比,MFC/IL-17细胞内趋化因子CCR6、CCL20、CXCL2和免疫调节因子VEGF、MMP-9、IL-6mRNA表达水平均显著增高(P<0.05)。4将MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17细胞接种615小鼠后,三组小鼠皮下均有肿瘤结节形成,但是,MFC/IL-17组小鼠的肿瘤生长速度及肿瘤质量均显著大于MFC和MFC/pcDNA3.1组(P<0.05)。5取三组小鼠肿瘤组织,分别用RT-PCR和Western-blot方法检测IL-17、VEGF和Podoplanin基因和蛋白表达,结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1组相比,MFC/IL-17组小鼠肿瘤组织内IL-17、VEGF和Podoplanin mRNA和蛋白表达水平均显著增高(P<0.05)。6免疫组化实验结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1组相比MFC/IL-17组小鼠肿瘤组织内CD31阳性细胞显著增多,微血管密度明显增加(P<0.05)。结论:1转染IL-17基因对小鼠胃癌细胞MFC的体外增殖活性和细胞凋亡率无明显影响,但可上调细胞内趋化因子CCR6、CCL20、CXCL2及免疫调节因子VEGF、MMP-9、IL-6的基因表达。2将MFC/IL-17细胞接种于615小鼠皮下后,可能通过上调VEGF、Podoplanin和CD31的表达促进肿瘤生长。