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经口免疫耐受(Oral Tolerance,OT)是通过激发小肠粘膜组织特别是与肠相关联的淋巴系统的正常免疫功能而达到阻断并抑制自身免疫功能,即通过口服与受攻击的组织类似的某种特异的外源性蛋白质来抑制自身的免疫疾病。目前,采用口服外源性蛋白质治疗自身免疫性疾病的研究有(1)牛髓磷脂蛋白治疗多皮硬化症[1]、(2)鸡Ⅱ型胶原蛋白(TypeⅡCollagen,CⅡ)治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)[2]、(3)牛S抗原治疗视网膜炎、(4)碱性髓磷脂蛋白治疗脑脊髓炎、(5)人胰岛素治疗I型糖尿病[3]等。口服CⅡ治疗RA已进入临床研究,显示出明显的药效作用并具有良好的安全性[4]。经口免疫耐受是否成功被诱导,与机体的免疫组织系统的状况、抗原的类型和性质等有关,准确的作用机制需要不断探索研究,而经口免疫耐受的形成和口服抗原的剂量密切相关[5]。国内外围绕CⅡ和RA展开了深入研究,力求探索RA发病机制和研发抑制或延缓RA疾病的药物[6]。口服诱导免疫耐受改善或治疗RA的方法还有许多问题亟待解决,例如抗原种类的选择、CⅡ抗原剂量的控制等,这些因素都能有效地影响经口诱导免疫耐受,同时还必须考虑到患者体质差异对相同剂量的CⅡ也会有强度不同的免疫应答。与目前的研究实验大多建立在动物模型上的事实相对应,人体临床实验仍然相对较少,其疗效还未得到充分肯定。但是作为一种潜在治疗RA的方法,仍需要进行更多的基础研究。国内外研究已经发现CⅡ具有诱导免疫耐受治疗关节炎的作用,并且基本明确这种经口免疫耐受作用通过肠免疫淋巴系统来实现,但其他部位的淋巴系统是否在免疫耐受过程中发挥了作用?程度大小?经口免疫耐受起始部分CⅡ和免疫细胞表面抗原受体的结合的分子机制是什么?因此,从CⅡ分子结构特征与经口免疫耐受关系的分子作用机制研究RA具有重要的理论意义与应用价值。通过大青鲨软骨Ⅱ型胶原蛋白(TypeⅡCollagen of Shark,SCⅡ)和其酶解得到的Ⅱ型胶原蛋白肽(TypeⅡCollagen peptide of Shark,SCⅡ-P)经口诱导免疫耐受治疗类风湿关节炎症的研究,发现抗原分子结构与免疫耐受之间的关系,解明免疫耐受治疗RA的作用机制是本研究的最终目标。第一章总结了人们对类风湿性关节炎症(RA)的形成原因以及口服来源不同的Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)治疗类风湿性关节炎症的研究进展;叙述了类风湿性关节炎(RA)的形成过程和发生发展的相关因子、治疗类风湿性关节炎的传统药物、CⅡ介于免疫耐受对类风湿性关节炎影响等。动物试验已经证实来源于鸡、羊、猪和牛等陆地动物Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)能够有效地缓解类风湿性关节炎症状,缩短该病病程[6]。但是由于口蹄疫、疯牛病、禽流感等疾病的流行,人们将关注点逐渐转移到海洋生物。鲨鱼软骨含有丰富的CⅡ,但是否与陆地源的CⅡ一样能够发生口服耐受抑制类风湿性关节炎仍然需要探索。第二章介绍了SCⅡ的分离提取纯化以及SCⅡ-P的制备。利用胃蛋白酶从大青鲨(Prionace glauca)软骨中提取SCⅡ,然后纯化,使用嗜热菌蛋白酶将SCⅡ水解。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定SCⅡ和SCⅡ-P的纯度和分子量,图谱上显示SCⅡ的α1链的分子量约为130kDa,而SCⅡ-P的分子量约为13kDa,无其它明显的杂带,说明提取得到的SCⅡ和SCⅡ-P达到了电泳纯。紫外扫描法的结果表明,SCⅡ的紫外最大吸收峰为226nm和260nm,SCⅡ-P在的紫外最大吸收峰为232 nm和277 nm。第三章研究了SCⅡ和SCⅡ-P的应用生化特性。通过差示扫描量热法分析了SCⅡ和SCⅡ-P的热变性温度;通过圆二色谱法分析了SCⅡ和SCⅡ-P的二级结构特征;紫外扫描法分析了SCⅡ和SCⅡ-P的紫外吸收特性和红外光谱法分析SCⅡ和SCⅡ-P的红外光谱特征;采用DPPH方法分析SCⅡ和SCⅡ-P的抗氧化水平。差示扫描量热仪的检测结果表明SCⅡ的热变性温度为40.3℃,而SCⅡ-P的热变性温度为19℃,而且实验也证实了盐浓度和氢离子浓度与它们的热变性温度有着密切关系,对SCⅡ的影响程度远远大于对SCⅡ-P的影响程度。红外光谱实验结果显示SCⅡ和SCⅡ-P最主要酰胺吸收带有所不同,SCⅡ和SCⅡ-P的酰胺Ⅰ分别为1643cm-1和1630cm-1、酰胺Ⅱ分别为1546cm-1和1552cm-1、酰胺Ⅲ分别为1254cm-1和1296cm-1、酰胺A分别为3403cm-1和3349cm-1,和酰胺B分别为2930cm-1和2989cm-1。抗氧化的结果表明SCⅡ和SCⅡ-P都具有清除自由能力,但其清除自由基的能力弱于现有的抗氧化剂BHT和Vc,但SCⅡ-P的清除自由基的能力要比SCⅡ的好,这可能是因为在SCⅡ-P含有更多的短肽残基,提供了更多的电子,这些电子可能会阻碍自由基通路(Radical chain pathway),同时利用自由基将它们转化成更稳定的物质。第四章研究了SCⅡ和SCⅡ-P对6T-CEM细胞生长状况的影响。试验结果表明,SCⅡ和SCⅡ-P有较好的生物活性,能够诱导6T-CEM的凋亡,细胞凋亡因子FAS/APO-1、活细胞数和半胱天冬酶在SCⅡ和SCⅡ-P控制组中明显高于空白组和对照组;胶原蛋白和6T-CEM的受体结合与其剂量有关,最适胶原蛋白剂量为10ug/mL。CⅡ含量较高的构成糖能够激活FAS的受体,从而促使6T-CEM细胞凋亡基因表达水平提高。通过荧光显微技术确定SCⅡ诱导的细胞凋亡可以导致6T-CEM细胞核的衰亡。同时发现胶原蛋白的分子量和糖链多寡也是6T-CEM细胞凋亡的关键因素,应该关联着免疫耐受。第五章研究了SCⅡ和SCⅡ-P对CD4+T细胞生长状况及对细胞凋亡因子产生的影响。试验结果表明,SCⅡ和SCⅡ-P对CD4+T细胞生长均有影响,SCⅡ在不同的浓度均能促进细胞生长,而SCⅡ-P只有在特定的浓度下(>10ug/ml)才能起到明显作用,这可能是由于SCⅡ和SCⅡ-P的氨基酸组成和糖基化程度的不同所造成的,这与SCⅡ和SCⅡ-P能够诱导免疫耐受的结果相结一致。CD4+T细胞的免疫应答能力受到显著地抑制,试验组的凋亡因子显著高于对照组,且SCⅡ组和SCⅡ-P组之间没有明显区别。由此表明,SCⅡ和SCⅡ-P能够诱导T细胞凋亡。上一章的结果类似,由此可以推断外周CD4+T细胞的凋亡和免疫耐受的建立、维持及调节有一定的联系,而这种结果需通过体内实验进一步去验证。第六章通过建立完全弗氏佐剂诱导的类风湿性关节炎大白鼠动物模型,同时评经口诱导免疫耐受治疗RA的效果,并探讨其治疗机理。将SCⅡ和SCⅡ-P作为控制组,将与已被证实过的对类风湿性关节炎有治疗效果传统中药雷公藤多苷(tripterygium wilfordⅡpolyglycosidium,TWP)作为阳性对照组。SCⅡ和SCⅡ-P可以缓解了大白鼠关节肿胀程度、减弱了迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)反应、降低了血清中循环免疫复合物(circμLating immune complexes,CIC)数量、升高了血清白介素-10(interleukins 10,IL-10)水平。通过高倍数体视显微镜和组织切片观察踝关节软骨滑膜表面的平整程度,结果显示,口服SCⅡ和SCⅡ-P能够促使受损的软骨表面恢复形成光滑的表面。