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羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)是由丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)和在我国还未发现的山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp. capricolum, Mcc)引起的羊的高度接触性传染病。以高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦,肺间质增生性炎症、胸和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症为主要病变特征。本病自首次报道以来,在畜牧业以羊养殖业为主的不发达国家广泛流行,给各国带来了严重的经济损失。由于药物治疗的效果不尽人如意,传统疫苗本身具有难以克服的局限,所以人们开始致力于新型药物和疫苗的研制。目前几乎没有保护性抗原基因的筛选及其详细的研究报道,因此为了寻找编码保护性抗原基因,本研究在对内蒙古地区病料样品进行病原分离、培养和鉴定的基础上,对病原体基因组进行了测序及生物信息学分析。通过基因工程方法,重组表达了丝状支原体山羊亚种PG3株的可变膜表面脂蛋白,制备重组亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的初步探讨,得到以下结果：1.从内蒙古包头、乌兰察布市和鄂尔多斯市采集了疑似患羊传染性胸膜肺炎的羊只的肺脏、气管、肝脏、胸水和心包积液共67份样品。从乌兰察布市和鄂尔多斯市采集的肺脏、气管和心包积液样品中分离到18株支原体。通过菌落形态特征观察、生理生化试验鉴定、16S rRNA基因PCR扩增和16S rRNA基因序列同源性分析以及生长抑制试验多项分类和鉴定方法证实了分离菌株EF1、EF2、EQ1、EQ2、EF26、EQ22、 WF1、WF2和WXB1为绵羊肺炎支原体,其中EF2、EQ2、WF1、WF2和WXB1分离自绵羊病例,EF1、EQ1、EF26和EQ22分离自山羊病例；分离菌株EF9、EQ9、EF12、EF13、 EF19、和EF21为精氨酸支原体；分离菌株EF22为丝状支原体山羊亚种；分离菌株EF4为解脲支原体。由此确定了内蒙古地区流行的羊支原体肺炎的主要致病菌型是绵羊肺炎支原体。2.本研究采用高通量Illumina测序技术对丝状支原体山羊亚种PG3株和绵羊肺炎支原体分离株WXB1的全基因组进行了测序与拼接,借助软件和数据库对全基因组序列所承载的遗传信息进行了注释和分析。丝状支原体山羊亚种PG3株基因组大小为1,025,065bp,GC%为23.61%,含有3个rRNA,28个tRNA,12个sRNA,预测含有846个编码基因,在基因组上未检测到GI,该菌株不存在IS或者ICE序列。该菌株具有丝状支原体山羊亚种特有的麦芽糊精/芽糖代谢途径。绵羊肺炎支原体分离株WXB1基因组大小为1,084,159bp,GC%为29.14%,含有3个rRNA,30个tRNA,11个sRNA,预测含有888个编码基因。根据COG分类和KEGG代谢通路分类,两个基因组中绝大多数基因主要与蛋白翻译、核糖体结构与合成、DNA复制与修复、糖代谢和环境信号传递与转换这几个方面有关。3.人们认为支原体在感染的不同阶段通过表面可变蛋白加强定殖和适应宿主的组织环境。可变表面脂蛋白对于支原体的抗原性、免疫调节和底物结合等有着重要的意义。在丝状支原体山羊亚种PG3株基因组中发现了三个串联排列的可变表面脂蛋白基因,即GL000459、GL000461和GL000462。采用PCR方法对这三个可变表面脂蛋白的编码成熟肽的基因区域进行特异性的扩增,成功构建了E.coli BL21(DE3)/pET-32a (+)-MmcGL000459、E. coli BL21(DE3)/pET-32a (+)-MmcGL000461和E. coli BL21(DE3)/pET-32a (+)-MmcGL000462原核表达系统。SDS-PAGE和Western-blot结果证明该原核表达系统正确表达了分子量分别为31kDa、40kDa、41kDa的重组蛋白。同时,Western-blot分析表明这三个重组蛋白具有免疫反应性。4.以重组蛋白制作的疫苗对小鼠进行免疫试验。通过ELISA方法测定三次免疫后小鼠的血清中特异性抗体的滴度。结果表明：经三次免疫后小鼠血清中均产生了抗体,重组蛋白免疫组与对照组相比差异显著(p<0.05)。通过调理吞噬试验、生长抑制试验评价融合蛋白体液免疫效果。结果表明：重组蛋白免疫小鼠的全血杀菌能力与对照组相比差异显著(p<0.05),生长抑制试验的结果为弱阳性。通过Thl/Th2类细胞因子水平检测和T淋巴细胞增殖试验进行细胞免疫的检测。Thl/Th2类细胞因子水平检测结果表明：重组蛋白免疫组细胞因子含量与对照组相比均升高。重组蛋白His-tag-GL000459显著提高IL-2和IL-4的产生(p<0.05),而IL-10和IFN-γ的含量稍有提高(p>0.05)；His-tag-GL000461能显著提高工L-2、IL-4、IL-10和IFN-γ4种细胞因子的产生(p<0.05); His-tag-GL000462能显著提高工L-2、IL-4和IFN-γ3种细胞因子的产生(p<0.05)；而IL-10的含量稍有提高(p>0.05)。T淋巴细胞增殖试验结果表明：抗原刺激组与对照组存在差异(p<0.05)。以上结果说明,我们研制的重组可变表面脂蛋白亚单位疫苗可以诱导试验动物机体的体液免疫和细胞免疫反应,并且能够刺激机体产生具有免疫保护功能的抗体,为研制羊支原体性肺炎基因工程亚单位疫苗提供了理论基础和试验依据。