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荧光寿命成像技术因其具有对微环境敏感、空间分辨率高、不依赖于荧光物浓度和激发光强度等特点,使它成为生物微环境测量的一种重要工具。然而,基于TCSPC的FLIM技术存在成像信噪比低、可测量最短寿命受响应函数宽度限制等问题,导致其测量精度较低。本文通过增强激发荧光效率、降低系统噪声和优化分析方法三个方面发展出高精度荧光寿命成像方法,并将该方法用于荧光鼠脑样本制备方案筛选、FRET效率准确性测量和超短荧光寿命测量的研究中。本文内容如下：(1)发展了一种简单易行荧光寿命成像系统的性能评估及优化方法。定量评估了TCSPC-FLIM的空间分辨率、成像信噪比、测量准确性等,发现成像信噪比对系统的成像精度影响最大。提出了利用降低系统噪声和增强激发荧光效率的方法两种方法来提高成像信噪比。结果表明对探测器制冷使图像信噪比提高了4倍,单光子激发比双光子激发显著增强了荧光激发效率。(2)提出将高精度荧光寿命成像方法用于荧光鼠脑样本制备方案筛选应用中,该方法相比于荧光强度成像方法使测量更精确、更快捷。定量比较了三种常用固定剂和包埋剂对荧光特性的影响,发现利用4%多聚甲醛固定和GMA(乙二醇甲基丙烯酸酯)包埋的鼠脑脑片背景荧光最弱。该方法大大缩短了实验样本量,使实验周期更短。(3)针对高精度荧光寿命成像技术在荧光共振能量转移研究中的应用,对我们的TCSPC-FLIM系统进行了优化,使其适用于高精度研究CFP-YFP FRET效率变化。研究表明,我们的TCSPC-FLIM系统可以测量3%的FRET效率变化,初步证明了高精度TCSPC-FLIM方法在微小FRET效率变化测量中的有效性。(4)研究了系统极限时间分辨率与荧光信号强度之间的关系,建立了一种超高精度寿命分析方法。比较了一阶力矩法(M1)与传统的最小二乘拟合法的荧光寿命定量分析能力,发现M1方法的测量精度仅受信号强度影响,而与时间通道无关。进一步发现,M1方法在下面两种情况下明显优于拟合法：寿命为70ps-3ns；信号强度小于103个光子。最后,对超短荧光寿命样品(CdS纳米线)进行定量分析,证明了M1方法在研究短寿命样本时比拟合法更优。该方法为精确测量短寿命荧光样品或是微小荧光寿命变化方面的研究提供新的途径。