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蜜蜂作为昆虫大家族中的一员,是一种很好的研究社会性行为的模式生物,而且一直是国内外的研究热点。特别是2006年10月26日,《nature》发表了蜜蜂基因组的全序列,标志着蜜蜂基因组的研究工作获得了具有里程碑意义的研究进展,此后,蜂学研究重点将转向蜜蜂基因功能的研究。本文通过构建中华蜜蜂8日龄工蜂头部cDNA文库,筛选获得了Apsimin基因的cDNA序列,全长407 bp,含一个243 bp的开放阅读框(ORF),编码78个氨基酸的多肽,其N端含有一个由24个氨基酸残基组成的信号肽,预计成熟肽的分子量为5.9 kDa。通过序列比对,发现中蜂Apisimin基因与西方蜜蜂和印度蜜蜂(Apis cerana indica)Apisimin基因的相似性分别为93%和100%。将Apisimin成熟肽编码区利用PCR进行扩增,将回收纯化后的PCR产物克隆到pUCm-T载体上,经测序分析鉴定的阳性质粒,用BamH I和Xho I双酶切后,回收目标片段后,与同样用BamH I和Xho I双酶切后的pET30a载体连接,转化BL(DE3)后,经PCR快速筛选和双酶切鉴定,筛选出正确的阳性菌株IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blot印迹分析。由于原核表达的蛋白多以包涵体的形式存在,故将Apisimin基因在Bac-to-Bac系统中进行表达。将Apisimin目的基因与用BamH I和Xho I双酶切后的pFastBacHTa载体连接,连接成功的pFastBacHTa-Apisimin质粒转化DH10Bac感受态细胞,重组Bacmid,用M13引物进行PCR鉴定,扩增出产物大小为2300+243=2543bp为正确重组的Bacmid-pFastBacHTa-Apisimin病毒粒子,随后在无血清条件下,用Fugen6介导重组BacmidDNA转染生长状态良好的家蚕细胞,感染72h后,收集细胞,用超声波破碎细胞壁后收集蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot印迹分析,结果显示表达后的产物为5.9 kDa,并能与6×his单抗发生免疫反应,Western-blot结果显示,Apisimin仅有一条特异性的条带。